臺灣博碩士論文加值系統

　　先前本實驗室已發現台灣 vancomycin-resistant Enterococcus faecium （VREfm）菌株多半帶有 vanB2基因叢，這對VREfm常被發現帶有 vanA基因或vanB基因卻極少發現帶有 vanB2基因的結果有著極大的差異，這個現象引起了我們有興趣來探討帶有vanB2基因的VREfm之菌株，本實驗室先前已定序部份vanB2基因叢，此次的研究目的在於(1)將過去我們所沒完成之全部的vanB2基因叢完成。(2)分析其與vanB2基因之異質性（heterogeneity）。(3)找出是否有其它的位置可能對於抗藥性大小的調節有影響
　　本實驗室先前已定序4354bp之vanB2基因叢，吾人以PCR的方法加上DNA自動定序方法將未完成之vanB2基因叢定序出來，而5'及3'端之vanB2基因叢吾人則利用single primer PCR的方法將兩末端的DNA序列定序出來，其結果與vanB基因叢上相對基因之相似度（homology）比較，vanRB2基因與vanRB基因有94.7%(628/663)的相似度，其中有35個核甘酸不同，vanSB2有96.4%(1295/1344)的相似度，其中有49個核甘酸不同，vanYB2基因與vanYB基因有94.1%(759/807)的相似度，其中有48個核甘酸不同，vanWB2與vanWB基因有95.7%(729/828)的相似度，其中有99個核甘酸不同，vanHB2與vanHB基因有94.9%(922/972)的相似度，其中有50個核甘酸不同，vanB2與vanB基因有95.5%(982/1092)的相似度，其中有90個核甘酸不同vanXB2與vanXB基因有95.4%(581/609)的相似度，其中有28個核甘酸不同，另外還有兩個spacer的相似度分別為94.9%(168/177) 與84.2%(16/19)，其各有9個及3個核甘酸不同。
　　同時我們也利用不同的分子生物分型法，如pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)，random amplified polymorphic DNA (RAPD)，聚合酵素連鎖反應（Polymerase Chain Reaction），核酸限制酵素切割反應（Restriction enzyme digestion）等方法去對這些菌種做分型的工作及異質性（hrterogeneity），結果發現所收集到的菌種大多數可能屬於同一選殖株，我們也針對異機會較大的spacer位置設計了一組能增幅spacer的核酸引子（2047F-2596R），結果顯示全部菌株都帶有同樣大小的PCR片段，表示了菌種間為同質性，以PCR方法發現VREfm之vanB2基因叢可能為Tn5382所攜帶，而其中vancomycin MICs較低的菌種其在5'端之Tn5382帶有一個約1.7kb的DNA插入基因（insertion），反之vancomycin MICs較高者發現在3'端的Tn5382附近也有一段約1.2kb的DNA基因序列，由此結果顯示此插入的序列可能調控著其抗藥性基因叢而造成其MICs的大小，這對於帶有vanB2gene的VREfm有著一定的重要意義。　　先前本實驗室已發現台灣 vancomycin-resistant Enterococcus faecium （VREfm）菌株多半帶有 vanB2基因叢，這對VREfm常被發現帶有 vanA基因或vanB基因卻極少發現帶有 vanB2基因的結果有著極大的差異，這個現象引起了我們有興趣來探討帶有vanB2基因的VREfm之菌株，本實驗室先前已定序部份vanB2基因叢，此次的研究目的在於(1)將過去我們所沒完成之全部的vanB2基因叢完成。(2)分析其與vanB2基因之異質性（heterogeneity）。(3)找出是否有其它的位置可能對於抗藥性大小的調節有影響
　　本實驗室先前已定序4354bp之vanB2基因叢，吾人以PCR的方法加上DNA自動定序方法將未完成之vanB2基因叢定序出來，而5'及3'端之vanB2基因叢吾人則利用single primer PCR的方法將兩末端的DNA序列定序出來，其結果與vanB基因叢上相對基因之相似度（homology）比較，vanRB2基因與vanRB基因有94.7%(628/663)的相似度，其中有35個核甘酸不同，vanSB2有96.4%(1295/1344)的相似度，其中有49個核甘酸不同，vanYB2基因與vanYB基因有94.1%(759/807)的相似度，其中有48個核甘酸不同，vanWB2與vanWB基因有95.7%(729/828)的相似度，其中有99個核甘酸不同，vanHB2與vanHB基因有94.9%(922/972)的相似度，其中有50個核甘酸不同，vanB2與vanB基因有95.5%(982/1092)的相似度，其中有90個核甘酸不同vanXB2與vanXB基因有95.4%(581/609)的相似度，其中有28個核甘酸不同，另外還有兩個spacer的相似度分別為94.9%(168/177) 與84.2%(16/19)，其各有9個及3個核甘酸不同。
　　同時我們也利用不同的分子生物分型法，如pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)，random amplified polymorphic DNA (RAPD)，聚合酵素連鎖反應（Polymerase Chain Reaction），核酸限制酵素切割反應（Restriction enzyme digestion）等方法去對這些菌種做分型的工作及異質性（hrterogeneity），結果發現所收集到的菌種大多數可能屬於同一選殖株，我們也針對異機會較大的spacer位置設計了一組能增幅spacer的核酸引子（2047F-2596R），結果顯示全部菌株都帶有同樣大小的PCR片段，表示了菌種間為同質性，以PCR方法發現VREfm之vanB2基因叢可能為Tn5382所攜帶，而其中vancomycin MICs較低的菌種其在5'端之Tn5382帶有一個約1.7kb的DNA插入基因（insertion），反之vancomycin MICs較高者發現在3'端的Tn5382附近也有一段約1.2kb的DNA基因序列，由此結果顯示此插入的序列可能調控著其抗藥性基因叢而造成其MICs的大小，這對於帶有vanB2gene的VREfm有著一定的重要意義。

　　The major of vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREfm) carrying vanB2 gene had been found by our group in Taiwan. These are extremely unusual findings because VREfm isolates usually contain the vanA or vanB gene, not the vanB2 gene. Therefore, we are very interesting in studying the strains with vanB2 gene. Parts of vanB2 gene cluster of these VREfm had been sequenced before. The three objective of this study are (1) to complete vanB2 gene clusters (2) to analyze the heterogeneity between the vanB and vanB2 gene (3) to Figure out which there is any on vanB2 gene which will affect site on vancomycin-resistance.
　　Our laboratory had sequenced the whole genes of vanYB2 gene, vanWB2, vanHB2 and vanB2 gene and the part of vanXB2 gene before (It totally are 4354 bp). I used the PCR and DNA autosequence methods to complete the remaining vanB2 gene clusters and used the single primer PCR to sequence the 5' and 3' -end of vanB2 gene cluster. The sequences were found to be homologous to the following genes: the vanRB2 gene (94.7% homology) has 35 nucleotides different from the vanRB gene. The vanSB2 gene (96.4% homology)has 49 nucleotides different from the vanSB gene. The spacer I (94.9% homology)has 9 nucleotides different from the vanB gene cluster. The vanYB2 (94.1% homology)has 48 nucleotides different from vanYB gene. The vanWB2 (95.7% homology)has 99 nucleotides different from vanWB gene. The vanHB2 (94.9% homology) has 50 nucleotides different from vanB gene. The vanB2 (95.5% homology)has 90 nucleotides different with vanB gene. The spacer II (84.2% homology)has 3 nucleotides different from the vanB gene cluster and the vanXB2 (95.4% homology) has 28 nucleotides different from vanXB gene.
　　A variety of molecular typing methods have been used to investigate these VREfm strain, including pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), random amplified polymorphic DNA (RAPD), Polymerase Chain Reaction (PCR), and restriction enzyme digestion. To determine the heterogeneity of these VREfm, PCR and restriction enzyme digestions have been analyzed on these VREfm with vanB2 gene. The results showed that these VREfm were found to have the same vanB2 gene cluster, suggesting that it may be derived from a single clone. Besides, the nontranscribed area of vanB gene cluster (between vanSB and vanYB genes) of these isolates have also been amplified by primers VB2047F and VB2596R. The sizes of PCR products of these isolates were found to be same. These results suggested that vanB2 gene clusters in these VREfm isolates are homogeneous in Taiwan. The PCR method has been used to find that vanB2 gene cluster in these VREfm isolates may be carry by transposon-Tn5382. We also found that VREfm with low MICs of vancomycin have insertion sequence(1.7kb) in upstream of Tn5382. Besides, there have 1.2 kb insertion sequence in downstream of Tn5382 when VREfm have high MICs of vancomycin. The functions of these insertion sequences remain to be solved.