臺灣博碩士論文加值系統

飲食與健康近年來逐漸受到重視，相關的食品成份中生物活性評估方法亦陸續被發展，其中以動物細胞培養模式，針對水產魚貝類進行研究時，曾發現鮑魚具有顯著之免疫活性，而本研究選擇同為鮑魚屬之九孔 (Haliotis diversicolor, Reeve) 進行生物活性評估，並與鮑魚作比較。將台灣養殖九孔的內臟與肌肉分開，肌肉部份先以40%酒精溶液萃取後於100oC沸水萃取30分鐘，加入50%硫酸銨沈澱分劃，經過透析、冷凍乾燥後保存備用。以無血清細胞培養模式來評估萃取物的活性，採用細胞增生活性為指標。將萃取物添加於各種免疫細胞評估生物活性，結果顯示九孔萃取物對於人類融合瘤細胞HB4C5可促進細胞增生與抗體分泌，並觀察到細胞凝集之現象；亦能促進類似人類單核球細胞U-937、類似人類巨噬細胞U-M、人類單核球細胞THP-1與類似老鼠巨噬細胞J774.1等吞噬細胞增生。將九孔熱水萃取物經過Phenyl-TOYOPEARL疏水性管柱層析及DEAE-TOYOPEARL陰離子交換樹脂管柱層析純化後，確認其分子量約為25∼30 kDa之蛋白。在加工理化特性方面，九孔熱水萃取物經100oC加熱處理60分鐘仍維持80%之細胞增生活性，經121oC加熱處理20分鐘，尚保有65%之細胞增生活性。以不同pH值之酸鹼緩衝溶液處理後，其細胞增生活性與未處理組比較並無顯著影響，顯示九孔熱水萃取物具良好之熱安定性與酸鹼安定性。在細胞膜醣基抑制作用分析上，以N-Acetyl-D-glucosamine和maltose添加於HB4C5細胞時，抑制細胞增生之效果最顯著。一氧化氮 (nitric oxide, NO)是評估巨噬細胞在宿主防禦系統中免疫力的指標；故本研究將九孔熱水萃取物之增生因子添加於巨噬細胞，在無血清的條件下培養24、48、72小時，結果NO的生成量隨著時間的增加而增加，當添加NO合成抑制劑NAME後NO的量下降，顯示九孔細胞增生因子誘導巨噬細胞產生NO的途徑是經由NOS的合成，另外在九孔之細胞增生因子與IFN-g共同作用下，NO的生成量比單獨添加IFN-g之正控制組低，其機制將有待進一步探討；但是在5%血清存在下，九孔細胞增生因子與IFN-g共同作用於巨噬細胞，則具有顯著的加乘作用。綜合以上結果得知九孔熱水萃取物具有免疫生物活性，未來應用於健康食品之開發，為深具潛力之原料。

The human diet contains a great variety of natural carcinogens, as well as many natural anticarcinogens. The physiological effects of food factors are of particular interest because they may be useful for human cancer prevention. Techniques for human cell culture will be useful both for basic studies of cell biology and for evaluation of physiologically active substance in vitro. Shellfishes are popular source of traditional Chinese medicine. In this study, Taiwan small abalone, Haliotis diversicolor was selected for immunological function assessment. Small abalone was separated into the viscera and muscle. The muscle was extracted by 40% ethanol, then boiled with hot-water (100°C, 30 min) and 50% ammonium sulfate saturation precipitation. In order to clarify performance at the cellular level, human-derived hybridoma and macrophage were cultured and treated in a serum-free system. The cell proliferation activation was used as indicators of function. Both hot-water extracts and ethanol extracts of small abalone promoted cell proliferation, immunoglobulin production and cell aggregation toward human hybridoma cell lines HB4C5, and promoted cell proliferation toward macrophage-like cell lines (U-937、U-M、THP-1 and J774.1). Small abalone hot-water extracts showed stable in acidic-base buffer treatment (pH 2-10). Cell proliferation activity remained about 80%, when being treated at 100oC for 60 min. In presence of small abalone hot-water extracts, the activity will be inhibited by N-Acetyl-D-glucosamine and maltose, these effectors on SAH and receptor interaction for cell activation are important. After purified by using Phenyl-TOYOPEARL hydrophobic interaction chromatography and DEAE anion-exchange chromatography, the proliferating factor was gained from SAH. The molecular weight of purified fraction was confirmed about 25-30 kDa by SDS-PAGE. In the absence of serum-free, the promoting factor of small abalone induced nitrite production after cultured J774.1 cell for 24, 48 and 72 h. In prescence of 5% serum, the promoting factor of small abalone induced nitrite production remarkably, and showed synergistic effect with IFN-g. The result obtained in this study indicated that the extract of small abalone should be good candidate for health food development. Further studies including structure, function and in vivo animals experiment of small abalone are needed for advanced health claim.

中文摘要 VI
英文摘要 VIII
壹、前 言 1
貳、文獻整理 3
一、食物與癌症 3
二、食品生物活性物質 5
三、台灣養殖九孔之簡介 6
四、人體之防禦系統與抗腫瘤免疫調節作用 9
五、動物細胞培養技術之發展 10
六、抗體生成及其功能 11
七、細胞增生評估方法 12
八、化學防癌活性 (Cancer chemopreventive activity) 14
九、巨噬細胞 (Macrophages) 之免疫功能 15
十、腫瘤壞死因子 (Tumor Necrosis Factor) 16
十一、細胞活化作用機制 17
十二、一氧化氮在生理上扮演之角色 17
參、材料與方法 20
一、實驗材料 20
1. 九孔來源 20
2. 細胞株 20
3. 藥品 20
4. 設備 24
二、實驗方法 25
1. 九孔活性物質之萃取 25
1-1. 肌肉部份之萃取 25
1-2. 內臟部份之萃取 26
2. 動物細胞培養 26
2-1. 浮游性細胞之培養 26
2-2. 附著性細胞之培養 26
3. 蛋白質之定量 27
4. 細胞增生之測定 (MTT assay) 27
5. 抗體分泌之測定 (ELISA assay) 28
6. 巨噬細胞活化之分析 28
7. 亞硝酸鹽之測定 (Nitrite determination) 29
8. 九孔萃取物中免疫活化因子之純化 30
8-1. Phenyl-TOYOPREARL管柱層析 (44×80 mm) 30
8-2. Phenyl-TOYOPREARL管柱層析 (1.6×16 cm) 30
8-3. DEAE-TOPOYEARL管柱層析 30
8-4. 抗體分泌及細胞增生活性測試 31
8-5. 電泳分析 31
9. 九孔熱水萃取物之理化特性分析 34
9-1. 酸鹼安定性試驗 34
9-2. 熱安定性試驗 34
9-3. 蛋白水解酵素處理 34
9-4. 九孔萃取物之醣含量分析 35
10. 九孔萃取物活化細胞性免疫機制之探討 35
10-1. 細胞膜加醣鏈 (Glycosylation) 抑制測試 36
10-2. 醣基抑制 (Sugar inhibition) 測試 36
10-3. 蛋白活化酵素 (Protein Kinase) 抑制測試 37
10-4. Ca2+結合測試 37
肆、結果與討論 38
一、細胞增生之測定 38
二、抗體分泌量之測定 40
三、亞硝酸鹽之測定 41
四、九孔萃取物中免疫活化因子之純化 41
五、九孔熱水萃取物之理化性質分析 42
1. 酸鹼安定性試驗 43
2. 熱安定性試驗 43
3. 九孔萃取物之醣含量分析 43
六、九孔萃取物促進細胞增生機制之探討 44
1. 醣基抑制測試 44
伍、結 論 45
陸、參考文獻 47

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