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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:蔡明璋
研究生(外文):Ming-Chang Tsai
論文名稱:發展精蟲內鈣離子濃度的螢光偵測法
論文名稱(外文):Development of a Fluorescence Method for the Measurement of Ca2+ in Sperm
指導教授:陳義雄陳義雄引用關係朱善德
指導教授(外文):Yee-Hsiung ChenSin-Tak Chu
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:生化科學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2000
畢業學年度:88
語文別:中文
論文頁數:83
中文關鍵詞:精子鈣離子螢光試劑
外文關鍵詞:spermcalciumfura2
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在哺乳動物的生殖作用中,精子的活動能力以及在生殖過程中所進行的各種生理反應,如獲能作用、高度活化現象以及頂體反應均極重要。而細胞內鈣離子的濃度則是影響精子這些生理反應的重要因素之一。利用螢光劑偵測鈣離子的方法以測量不同處理之精蟲細胞內的鈣離子濃度變化是本論文的研究重點。
螢光試劑Fura2-AM可進入細胞內後,再分解成Fura2。利用Fura2和鈣離子在細胞內形成複合物所呈現的螢光特性可以偵測精蟲內鈣離子濃度。精蟲內螢光光度可於顯微鏡下由目鏡作初步的定性分析,依理可由顯微影像作定量分析,但本研究室該項設備不完整,目前無法進行。因此,採用螢光光度儀和45Ca 作定量分析,以比對二法所得的結果。

In mammal reproduction, the vitality of the sperm and all the going-on morphological changes, such as capacitation, hyperactivation and acrosome reaction, are extremely important. The intracellular concentration of calcium is one of the fatal factors influencing these changes. The main goal of this study is to develop a fluorescence method for the measurement of Ca2+ in sperm. As well know, Fura2-AM is transformed to Fura2 through the hydrolysis of esterase, once it is transported to the cell. Thereby, Fura2 can be complexed with intracellular Ca2+ to give the characteristic fluorescence. The fluorescence intensity due to the complex is visible under a microscope and can be guantitized in principle by a image analyzer. However, our laboratory has not well equipped with that kind of instrument. Instead, I measured the intracellular Ca2+ by either a fluorometer or by 45Ca -uptake. The results of both methods are comparable.

目錄…………………………………………………………….………...1
圖表目錄……………………………………………………….………...3
中文摘要…………………………………………………..….………….4
Abstract……………………………………….…………………5
縮寫表…………………………………...……………………………….6
論文內容
第一章 緒論……………………………………………………………..7
1—1 精子生成及結構…………………………………………..…...8
1—2 受精作用……………………………………………………….8
1—2—1 精子的獲能作用………………………………………………...….9
1—2—2 精子的頂體反應……………………….………………………….10
1—3 細胞內的離子…………………………………….…………..11
1—4 蛋白抑制因子……………………..……………………….12
1—5 研究細胞內鈣離子濃度的方法…………………………..….13
1—5—1 螢光偵測法………………………………………………………..13
1—5—2 放射性同位素………………………………………………….….15
第二章 實驗材料與方法………………………………………..……..16
2—1 胰蛋白抑制因子的純化……………………………..…….20
2—1—1 儲精囊液取得……………………………………………..………20
2—1—2 硫酸銨沈澱………………………………………………………..20
2—1—3 分子篩膠體層析法………………………………………………..20
2—1—4 逆向高效能層析法………………………………………………..21
2—1—5 蛋白質定量分析…………………………………………………..23
2—1—6 SDS-聚丙烯醯銨膠體電泳………………………………………..24
2—1—7 西方點墨法………………………………………………….…….26
2—1—8 酵素活性的測定…………………………………………………..26
2—2 Fura2-AM對精子的影響……………………………..……….27
2—2—1 CASA分析方法………………………………………..…………..27
2—2—2 獲能作用的觀察……...……………………….…………………..28
2—2—3 頂體完整性的觀察…………..…………………...……………….29
2—3 螢光分光光度儀分析細胞內鈣離子………………………...30
2—3—1 精子製備…………………………………….…………………….30
2—3—2 連續偵測細胞內鈣離子…………………………………………..31
2—3—3 F4500螢光波長分析…………………..…………………………..31
2—4 數位影像螢光分析細胞內鈣離子…...………………………33
2—4—1 CCD數位影像分析…………………………..……………………33
2—4—2 HAMAMATSU影像分析…………………………………...……..33
2—5 細胞內同位素鈣測定……………………………………...…34
第三章 實驗結果…………………………………...………………….35
3—1 胰蛋白抑制因子的純化及鑑定…………………………...36
3—2螢光劑Fura2、Fura2-AM與鈣離子結合的螢光光譜.………36
3—3 Fura2-AM濃度對精蟲生理狀態的影響…………………...…38
3—4 精蟲中鈣離子濃度的測定………..………………………….39
3—4—1 螢光光度儀偵測…………………………………………………..39
3—4—2 螢光顯微影像分析………………………………………………..40
3—4—3 放射線同位素鈣偵測法……………….……………………….41
第四章 討論……………………………………………………………43
第五章 參考文獻………………………………………………………46
圖表目錄
圖次
圖一 TI的純化…………………………………………………………………52
圖二 儲精囊的電泳分析與鑑定……………………...……………………….54
圖三 Fura2及Fura2-AM的吸光光譜…………………………………………56
圖四 Fura2、Fura2-AM與鈣離子結合的螢光光譜………………….………58
圖五 螢光試劑Fura2-AM對精子活動能力的影響………………………….60
圖六 螢光試劑Fura2-AM對精子獲能作用及頂體的影響………………….62
圖七 利用螢光分光光度儀偵測精蟲內鈣離子濃度的變化…………………64
圖八 利用F4500螢光儀之測鈣軟體分析……………………..……………..66
圖九 細胞外高鈣離子濃度對精蟲對鈣離子吸收的影響……………………68
圖十 顯微影像分析觀察細胞內鈣離子………………………………………70
圖十一〜十三 利用同位素鈣測量細胞內鈣離子的濃度……………..72~77
表次
表一 顯微影像分析數值………………………………………………………78
附圖
附圖一:精子的成熟過程………………………………………………..……..80
附圖二:小白鼠的精子結構圖……………………..…………………..………81
附圖三:精子的細部構造圖……………………………………………………82
附圖四:利用CTC 分析精蟲之生理狀態……………………………………..83

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