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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:林憲志
研究生(外文):Hsien-Chih
論文名稱:核醣體DNA標示在果實蠅及米象類鑑定上之應用
論文名稱(外文):Application of rDNA markers in identification of fruit flies and grain weevils
指導教授:王重雄彭武康彭武康引用關係陳秋男
指導教授(外文):Chung-Hsiung WangWu-Kang PengChiou-Nan Chen
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:昆蟲學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2000
畢業學年度:88
語文別:中文
論文頁數:55
中文關鍵詞:核醣體DNA東方果實蠅瓜實蠅米象玉米象
外文關鍵詞:ribosomal DNABactrocera dorsalisBactrocera cucurbitaeSitophilus oryzaeSitophilus zeamais
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害蟲鑑定工作常因種類繁多、可採得樣本數少或殘缺、處於卵期或幼蟲期、外部形態特徵相近、飼養困難及多型性等因素,造成害蟲鑑定上之困難。以分子標示 (molecular marker) 為基礎之鑑定則可避免上述的困難。本論文以昆蟲基因組 DNA (genomic DNA) 及核醣體 DNA (ribosomal DNA, rDNA) 為材料,利用 DNA 逢機增幅多形性-聚合連鎖反應 (RAPD-PCR)、DNA 增幅指紋 (DAF) 與聚合酶連鎖反應─限制片段長度多形性 (PCR-RFLP) 等分子標示,進行瓜實蠅 (Bactrocera cucurbitae (Coquillett))、東方果實蠅 (B. dorsalis (Hendel))、米象 (Sitophilus oryzae (L.)) 及玉米象 (S. zeamais Motschulsky) 之快速鑑定。
在 RAPD-PCR 方面,利用逢機引子 UBC-431 對瓜實蠅、東方果實蠅、米象及玉米象之基因組 DNA 進行逢機擴增,結果在果實蠅類兩種類之主要擴增片段圖譜具有差異,在米象類兩種類之主要擴增片段圖譜亦具有差異,雖然結果顯示有個體差異之情況,但仍可據此圖譜鑑別其種類。DAF 是以醛縮 (aldolase)、催乳激素受器 (prolactin receptor) 與白血球間素─1β (interleukin-1β) 之引子組,分別對瓜實蠅、東方果實蠅、米象及玉米象之基因組 DNA 進行 PCR 擴增,進行膠體電泳分離後,即可藉此 DAF 圖譜鑑定此兩種相近的種類。利用 rDNA 具有普遍存在、保守性高、重複數多與區段變異等特性進行 PCR-RFLP 分析,以高保守性區域之序列所設計之引子擴增 rDNA 中之特定片段 (18S 加上 ITS 片段、ITS-1 及 ITS-2 片段),再分別以 AccI、BamHI、EcoRI、EcoRV、HindIII、PstI、SalI、SmaI、SphI、XbaI及XhoI 等限制進行切割後,呈現不同的限制圖譜 (restriction map),亦可據此圖譜分別鑑定果實蠅類及米象類之種類。此外,分別以引子 ITS1/ITS2 和 ITS3/ITS4 擴增果實蠅及米象類之 ITS-1 及 ITS-2 片段,擴增出的 ITS 片段經核酸定序並比較其序列組成後,再設計出具有種別鑑定之特異性引子,即能進行快速鑑定。由此可見以分子生物學為基礎的害蟲檢疫工作可提供更快速、更有效且更準確的昆蟲鑑定方法,亦可輔助外部形態鑑定的不足並肯定外部形態鑑定的結果,避免鑑定錯誤的發生。
The melon fly, Bactrocera cucurbitae (Coquillett), oriental fruit fly, B. dorsalis (Hendel), rice weevil, Sitophilus oryzae (L.), and the maize weevil, S. zeamais Motschulsky, were discriminated by DNA markers, including random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR), DNA amplification figerprinting (DAF), PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), and ribosomal DNA (rDNA) amplification. Analysis with RAPD-PCR provided diagnostic markers. Patterns of the amplicons of both two fruit flies and two weevils with UBC-431 primer are different. DAF with three sets of primers, aldolase, prolactin receptor, and interleukin-1b was used for identification by PCR. Fingerprint profiles were generated from both two fruit flies and two weevils, and DAF was able to distinguish two fruit flies effectively. Due to the high similarity in patterns of amplicons after DAF amplification, it showed that two weevils were closely related. The intervening internal transcribed spacer regions (ITS-1 and ITS-2) of rDNA were amplified by PCR and sequenced. The homology between B. cucurbitae and B. dorsalis in ITS-1 nucleotide sequences was 64 %, and in ITS-2 was 84 %, and between S. oryzae and S. zeamais was 96 % and 97 % respectively. Based on the sequences of ITS-1 and ITS-2, two specific primer sets were designated and named ITS3/So and ITS3/Sz. With the primer set ITS3/So, 450 bp DNA fragment yielded with S. oryzae genomic DNA after PCR amplification, but no any product with S. zeamais. With the primer set ITS3/Sz, 550bp DNA fragment yielded with S. zeamais genomic DNA after PCR amplification, but no any product with S. oryzae. These two primer sets will provide a reliable tool for identification of these two weevils. In addition, we suggest that the variation of intraspecies sequence in ITS-1 or ITS-2 region of rDNA of both weevils collected from different geographic areas still need to be elucidated.
壹、前言.....................................1
貳、往昔研究.................................3
一、果實蠅類...............................3
二、米象類.................................5
三、分子標示...............................7
參、材料與方法..............................12
一、供試昆蟲..............................12
二、基因組 DNA 萃取.......................12
三、RAPD-PCR..............................14
四、DAF ...................................15
五、PCR-RFLP..............................15
六、定序及序列分析........................16
七、專一性 PCR............................16
肆、結果....................................18
一、RAPD-PCR..............................18
二、DAF ...................................19
三、PCR-RFLP..............................20
四、序列分析..............................22
五、專一性 PCR............................24
伍、討論....................................26
陸、參考文獻................................37
柒、誌謝....................................42
捌、圖表....................................43
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