臺灣博碩士論文加值系統

D-麩胺酸 （D-Glutamic acid）及其衍生物為製藥工業上重要之中間物，D-熱麩胺酸 （D-pyroglutamic acid）主要可用做光學活性物質之光學分割劑以及用來合成 pyrrolidone衍生物之原料。本論文研究以 L-麩胺酸鈉鹽為起始原料，利用化學法於高溫鹼性條件下將其消旋成 D,L-麩胺酸，再利用 Escherichia coli ATCC 11246菌體中之 L-麩胺酸脫羧基酶 （L-glutamate decarboxylase）將其中 L-麩胺酸轉化為 γ-胺基酪酸 （γ-aminobutyric acid），再利用濃縮結晶法將 D-麩胺酸分離出來，再進一步利用高溫脫水環化法將 D-麩胺酸轉化為 D-熱麩胺酸。
麩胺酸於 160℃，pH＞13其消旋速率常數為 2.3×10-3 min-1，醱酵培養 E. coli ATCC 11246其菌體中之 L-麩胺酸脫羧基酶之最適反應 pH值為 pH 4.4，經 PVA固定化之後，其最適 pH仍在 3至 5之間。新鮮之自由狀態菌體，置 —4℃保存一個月之自由狀態菌體，及置 —4℃保存一個月以 PVA包埋固定之菌體，其 L-麩胺酸脫羧基酶最大反應速率 （Vm）分別為 7.63、3.51、6.67 U/mg-D.C.W，以聚乙烯醇 （PVA）固定化之菌體，在 1％基質濃度下進行 L-麩胺酸脫羧基反應，重複五次反應後仍有 77％之相對活性。含 L-麩胺酸脫羧基酶之菌體與消旋反應所產生之 D,L-麩胺酸，將 pH值控制在 4.80於 37℃行脫羧基反應，再以濃縮結晶法進行 D-麩胺酸之回收純化可得 77.81％之收率。將 0.05 g D-麩胺酸粉末在 180℃加熱脫水反應，可於 5分鐘完全轉化為 D-熱麩胺酸。

D-glutamic acid is also the precursor for the synthesis of D-pyroglutamic acid. D-pyroglutamic acid has been used as a resolution reagent and the starting material for the synthesis of pyrrolidone derivatives. In this study, mono sodium glutamate was racemized at alkaline condition into D,L-glutamate. The L-glutamate was converted to GABA by using the glutamate decarboxylase of Escherichia coli ATCC 11246. D-glutamate was then purified from the GABA solution. The D-pyroglutamate was prepared by dehydrating the D-glutamate powder.
At 160℃, pH＞13, L-glutamate was racemized into D,L-glutamate. The racemization constant is 2.3×10-3min-1. Optimum pH for the E. coli cell to convert L-glutamate into GABA is in the range of 3~5. The kinetic constant Vm of free cell, free-cell stored at -4℃ for one month, and PVA immobilized-cell stored at -4℃ for one month are 7.63, 3.51, 6.67 U/mg-D.C.W., respectively after five repeated batches reaction at 37℃,the relative activity of the immobilized cell was 77％. The recovery yield of D-glutamate prepared from L-glutamate through chemical racemization and decarboxylaion steps was 77％.

目錄
中文摘要………………………………………………………………Ⅰ
英文摘要………………………………………………………………Ⅲ
目錄…………………………………………………………………….Ⅳ
圖目錄…………………………………………………………………Ⅷ
表目錄………………………………………………………………....ⅩⅠ
第一章 緒論…………………………………………………………...1
1.1 文獻回顧及研究背景…………………………………………….....1
1.1.1 研究目的………………………………………………………..1
1.1.2 胺基酸及 D型胺基酸…………………………………………1
1.1.3 D型麩胺酸及D型熱麩胺酸………………………………….13
1.1.4 胺基酸之消旋…………………………………………………15
1.1.5 L-麩胺酸脫羧基酶………………………………………….…18
1.1.6 研究內容………………………………………………………21
第二章 實驗材料設備與方法…………………………………….24
2.1 實驗材料…………………………………………………………...24
2.1.1 酵素反應試藥…………………………………………………24
2.1.2 醱酵試藥………………………………………………………25
2.1.3 固定化菌體試藥………………………………………………25
2.2 儀器設備…………………………………………………………...26
2.2.1 醱酵儀器………………………………………………………26
2.2.2 L-麩胺酸消旋及 D-麩胺酸脫水環化設備…………………..26
2.2.3 分析儀器………………………………………………………27
2.2.4 反應儀器………………………………………………………27
2.3 研究方法…………………………………………………………...28
2.3.1 Lactobacillus brevis ATCC 8287菌體之保存活化及醱酵槽培養……………………………………………………………….28
2.3.1.1 菌體液體培養基之製備………………………………………28
2.3.1.2 菌種之活化與保存……………………………………………28
2.3.1.3 冷凍保存菌種之再活化………………………………………30
2.3.1.4 菌體生長濃度之檢測…………………………………………30
2.3.1.5 試管培養………………………………………………………30
2.3.1.6 搖瓶培養………………………………………………………30
2.3.1.7 醱酵槽培養……………………………………………………31
2.3.2 L-麩胺酸之消旋………………………………………………31
2.3.3 含 L-麩胺酸脫羧基酶活性之 E. coli ATCC 11246菌體之醱酵培養…………………………………………………………….33
2.3.3.1 菌體液體培養基之製備………………………………………33
2.3.3.2 菌體之活化與保存……………………………………………33
2.3.3.3 菌體生長濃度之檢測…………………………………………33
2.3.3.4 試管培養………………………………………………………34
2.3.3.5 搖瓶培養………………………………………………………34
2.3.3.6 醱酵槽培養……………………………………………………34
2.3.3.7 甲苯 （Toluene）處理對菌體活性之影響……………………34
2.3.4 Pyridoxal-5’-phosphate （PLP）及 pH值對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響…………………………………………………….35
2.3.4.1 Pyridoxal-5’-phosphate （PLP）對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響……………………………………………………………….35
2.3.4.2 pH值對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響…………………….…36
2.3.5 D-麩胺酸及 NaCl對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響…………36
2.3.5.1 D-麩胺酸之影響………………………………………………36
2.3.5.2 鹽濃度對麩胺酸脫羧基反應之影響…………………………39
2.3.6 以 PVA固定化含麩胺酸脫羧基酶之 E. coli菌體…………..39
2.3.6.1 聚乙烯醇 （PVA）進行菌體之固定化………………………39
2.3.6.2 利用固定化菌體進行批次反應………………………………40
2.3.6.3 2.3.6.3利用固定化菌體進行重複批次反應…………………40
2.3.6.4 自由狀態菌體及固定化菌體 L-麩胺酸脫羧基反應之動力學分析…………………………………………………………….41
2.3.7 以高溫鹼催化消旋反應產生之 D,L-麩胺酸為基質，行 L-麩胺酸之脫羧基反應…………………………………………….41
2.3.8 D-麩胺酸 （D-Glu）及 D-熱麩胺酸 （D-pyroglu）之回收純化……………………………………………………………….41
2.3.8.1 D,L-麩胺酸之製備…………………………………………….42
2.3.8.2 D-麩胺酸之製備………………………………………………42
2.3.8.3 D-熱麩胺酸之製備……………………………………………42
第三章 結果與討論………………………………………………...45
3.1 含麩胺酸消旋酶之 Lactobacillus brevis ATCC 8287之醱酵培養45
3.2 L-麩胺酸之鹼催化消旋……………………………………………45
3.3 含 L-麩胺酸脫羧基酶活性之 E. coli ATCC 11246菌體之醱酵培養…………………………………………………………………...53
3.4 Pyridoxal-5’-phosphate（PLP）及 pH值對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響……………………………………………………………...55
3.5 D-麩胺酸及 NaCl對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響……………..58
3.6 以 PVA固定化含麩胺酸脫羧基酶之 E. coli菌體………………60
3.7 以高溫鹼催化消旋反應產生之 D,L-麩胺酸為基質，行 L-麩胺酸之脫羧基反應……………………………………………………...68
3.8 D-麩胺酸 （D-Glu）及 D-熱麩胺酸 （D-pyroglu）之回收純化…………………………………………………………………...76
第四章 結論與建議………………………………………………...79
參考文獻………………………………………………………………82
圖目錄
圖 1-1 使用 D,L-5-substituted hydantoin為基質，利用 D-乙內醯月尿酶及D-醯胺水解酶生產 D-胺基酸…………………………..11
圖 1-2 以 L-麩胺酸鈉鹽為原料，生產 D-熱麩胺酸之反應流程圖...22
圖 2-1 高溫鹼催化消旋之反應裝置圖………………………………32
圖 2-2 L-麩胺酸檢量線……………………………………………….37
圖 2-3 D-麩胺酸檢量線………………………………………………38
圖 2-4 以 180℃高溫催化 D-麩胺酸轉化為 D-熱麩胺酸之反應裝置圖……………………………………………………………….44
圖 3-1 Lactobacillus brevis ATCC 8287之發酵生長曲線…………...46
圖 3-2 利用矽油浴於 160℃，pH＞13，L-麩胺酸之消旋反應結果…47
圖 3-3 利用矽油浴於 180℃，pH＞13，L-麩胺酸之消旋反應結果…48
圖 3-4 180℃、pH＞13，進行 1、3、6小時消旋之層析圖…………….51
圖 3-5 消旋 L-麩胺酸，以 t vs ln[(1+D/L)/(1-D/L)]作圖…………...52
圖 3-6 E. coli ATCC 11246之醱酵生長曲線及其 L-麩胺酸脫羧基酶活性分析……………………………………………………….54
圖 3-7 pH值對菌體中麩胺酸脫羧基酶活性之影響………………...57
圖 3-8 pH值對 PVA固定化菌體之麩胺酸脫羧基酶活性之影響………………………………………………………………61
圖 3-9 固定化菌體轉化 L-麩胺酸產生 γ-胺基酪酸之反應……...62
圖 3-10 固定化菌體顆粒重複批次反應………………………………63
圖 3-11 新鮮之自由狀態菌體與不同之基質濃度進行麩胺酸脫羧基反應，由實驗值所繪之Lineweaver-Burk plots關係圖………….65
圖 3-12 置 —4℃保存一個月之自由狀態菌體與不同之基質濃度進行麩胺酸脫羧基反應，由實驗值所繪之Lineweaver-Burk plots關係圖………………………………………………………….66
圖 3-13 置 —4℃保存一個月以 PVA包埋固定之菌體與不同之基質濃度進行麩胺酸脫羧基反應，由實驗值所繪之Lineweaver-Burk plots關係圖……………………………………………………67
圖 3-14 使用鹼催化消旋法所製備之 D,L-麩胺酸溶液與自由狀態菌體進行麩胺酸脫羧基反應，無 pH控制……………………...71
圖 3-15 使用鹼催化消旋法所製備之D,L-麩胺酸溶液與自由菌體進行麩胺酸脫羧基反應，有 pH控制…………………………...…72
圖 3-16 使用鹼催化消旋法所製備之D,L-麩胺酸溶液與固定化菌體進行麩胺酸脫羧基反應，無 pH控制…………………………...73
圖 3-17 使用鹼催化消旋法所製備之D,L-麩胺酸溶液與固定化菌體進行麩胺酸脫羧基反應，有 pH控制…………………………...74
圖 3-18 固定化菌體進行 L-麩胺酸脫羧基反應之層析圖…………...75
圖 3-19 以濃縮結晶法生產之 D-麩胺酸利用 HPLC分析之層析圖.76
圖 3-20 以矽油浴 180℃於 2、3、5分鐘加熱D-麩胺酸轉化為熱麩胺酸之層析圖…………………………………………………….78
表目錄
表 1-1 存在於生物體中之天然 D型胺基酸………………………….4
表 1-2 使用酵素來生產 D-胺基酸的方法……………………………7
表 1-3 一些胺基酸及其衍生物之鹼催化消旋機構…………………17
表 1-4 乳酸菌中 glutamate racemase之分布情形…………………..19
表 1-5 不同之硫醇聚合物試劑對酵素活性之影響…………………19
表 1-6 一些胺基酸中常見的酵素脫羧基化反應……………………20
表 3-1 Toluene處理對 E. coli ATCC 11246菌體活性之影響………55
表 3-2 Pyridoxal 5’-phosphate對 L-麩胺酸脫羧基反應之活性的影響………………………………………………………………55
表 3-3 D-麩胺酸對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響…………………..58
表 3-4 鹽濃度對 L-麩胺酸脫羧基反應之影響……………………...59
表 3-5 固定化菌體重複反應其活性之影響…………………………64
表 3-6 不同條件下之E. coli ATCC 11246菌體其反應之動力學常數………………………………………………………………68

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