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研究生:黃幼念
研究生(外文):Huang Yu-Nien
論文名稱:利用溶膠凝膠法製備載體固定酵素
論文名稱(外文):Preparation of immobilized enzyme by sol-gel processes
指導教授:陳志平陳志平引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:長庚大學
系所名稱:化學工程研究所
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2001
畢業學年度:89
語文別:中文
論文頁數:123
中文關鍵詞:溶膠凝膠固定化酵素海藻酸
外文關鍵詞:sol-gelimmobilized enzymealginatePVF
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本實驗主要研究方向是以不同製備方式及不同形式之支持體,以溶膠凝膠法將酵素包埋在溶凝膠體內,藉以製備固定化酵素。
本研究分為兩個部分。第一部份:利用海藻酸鈣為支持體,以溶膠凝膠法包埋青黴素醯胺。首先決定其最適固定化條件,再以此條
件製得之固定化酵素,比較固定化前後酵素基本性質的差異。結果顯
示經過固定化後的酵素,其基本性質與自由酵素沒有很明顯地差異;
但在高溫下之溫度穩定性、室溫中之儲存穩定性及重複使用性質均優於自由酵素。
第二部分:以不同支持體之溶膠凝膠法製備固定化脂肪分解酵
素,在生產醋酸香葉酯之反應系統中測定活性。首先以海藻酸鈣膠體圓珠與PVF plates為支持體,將含有酵素分子的膠體披覆於不同支持
體上進行聚合。其次利用油相懸浮法直接製備溶凝膠體顆粒。除分別探討其最適固定化條件外,並比較不同形式之固定化酵素與自由酵素
基本性質的差異。
由實驗結果得到以海藻酸鈣膠體為支持體之固定化酵素,其比活性約為自由酵素的4.5倍;而PVF plates支持體之固定化酵素為7.4倍。經過固定化後,明顯的增加酵素的熱穩定性與室溫中的儲存穩定性,以及降低在較高基質濃度之抑制效應。在重複使用四次下,酵素活性仍然維持原有活性的50%。利用油相懸浮法直接進行聚合反應,初步結果顯示以此法來包埋酵素是可行的。
Immobilized enzymes were prepared by using a sol-gel technique in which enzyme-entrapped gels were crosslinked on the surface of porous supports. It can be divided into two parts.
Penicillin acylase was firstly immobilized in an alginate-silicate gel beads
at various conditions. No apparent difference between the properties of
immobilized enzymes and free enzymes. However, the immobilized
enzyme showed enhanced thermal stability at higher temperatures and
storage stability at room temperature.
The gel-entrapped lipases were then prepared by using different types of
supports by a sol-gel process. The enzyme activities were determined in
the esterification of acetic acid with geraniol in hexane to give geranyl acetate. Lipase-containing hydrophobic organic/inorganic hybrid silica gel was fixed on alginate gel beads and porous PVF plates, and prepared sol-gel particles by oil suspension method. Optimum immobilization conditions were found, and the characteristic properties of immobilized enzymes were compared with those of free enzymes.
The results demonstrated that lipase entrapped in alginate-silicate sol-gel matrix display higher catalytic activity by a factor of 4.5 relative to the lipase powders suspended in organic solvents. Moreover, activity enhancement by a factor of 7.4 was found by using PVF plates as the support. The immobilized enzymes showed substantially improved thermal stability and storage stability at room temperature. The inhibitive effects at higher substrate concentration was also reduced. The immobilized enzyme could be reused for at least four cycles with retention of 50% of the initial activity. Forming sol-gel beads by inverse suspension polymerization in oil phase also appeared to be applicable for lipase immobilization.
指導教授推薦書…………………………………………………………...i
論文口試委員會審定書…………………………………………………..ii
授權書…………………………………………………………………….iii
致謝……………………………………………………………………….iv
總目錄………………………………………………………………….….v
表目錄…………………………………………………………………….ix
圖目錄………………………………………………………………….….x
中文摘要………………………………………………………………...xiii
英文摘要………………………………………………………………...xiv
第一章 緒論……………………………………………………………….1
1-1研究背景…………………………………………………………..1
1-2研究目的與範疇……………………………………………….….2
第二章 原理及文獻回顧………………………………………………...4
2-1青黴素(penicillin)………………………………………………....4
2-2青黴素醯胺(penicillin acylase).………………………………...5
2-3酵素固定化(enzyme immobilization).……………………………6
2-4海藻酸(alginic acid).……………………………………….….…10
2-5脂肪分解酵素(lipase).…………………………………………....12
2-6酯類(ester).………………………………………………….……16
2-7溶膠-凝膠法之原理……………………………………………..17
2-8溶膠-凝膠法在固定化生物觸媒之應用…………………….….22
2-9利用海藻酸鈣膠體為支持體以溶膠凝膠法包埋酵素之回顧
...………………………………………………………………...27
2-10利用溶膠凝膠法包埋脂肪分解酵素之回顧…………………..27
第三章 研究方法與步驟………………………………………………..29
3-1實驗藥品………………………………………………………...29
3-2實驗儀器………………………………………………………...30
3-3實驗方法………………………………………………………...31
3-3.1酵素蛋白質測定…………………………………………...31
3-3.2利用海藻酸鈣膠體為支持體以溶膠凝膠法包埋青黴素醯胺………………………………………………...……..33
3-3.3青黴素醯胺之活性測定………………………………..34
3-3.4利用海藻酸鈣膠體為支持體以溶膠凝膠法包埋脂肪分解酵素……………………………………………………….36
3-3.5利用PVF為支持體以溶膠凝膠法包埋脂肪分解酵素….37
3-3.6利用油相懸浮法製備包埋脂肪分解酵素之溶膠凝膠顆粒
..………………………………………………………….37
3-3.7脂肪分解酵素之活性測定………………………………..38
3-3.8定義與數據分析…………………………………………..39
第四章 結果與討論…………………………………………………….44
第一部份:利用海藻酸鈣膠體圓珠為支持體以溶膠凝膠法
包埋青黴素醯胺………………………………...44
4-1最適固定化製備方法…………………………………………...44
4-1.1自由酵素比活性測定…………………………………..…44
4-1.2不同形式前驅物( Rn-Si(OCH3)4 – n )之影響…………...…44
4-1.3不同MTMS與TMOS比例之影響……………………....45
4-1.4最適固定化結果…………………………………………..45
4-2固定化酵素基本性質的探討…………………………………...49
4-2.1固定化酵素之物理性質…………………………………..49
4-2.2反應溫度對活性的影響………………………………..…49
4-2.3 pH值對活性的影響………………………………………49
4-2.4溫度穩定性…………………………………………..……50
4-2.5室溫下之儲存穩定性…………………………………..…50
4-2.6重複使用性……………..………………………………....50
4-2.7不同酵素濃度包埋之影響..……………………………....51
第二部份:不同支持體之溶膠凝膠法製備固定化脂肪分解酵素生產醋酸香葉酯之反應系統……………………...62
<利用海藻酸鈣膠體圓珠為支持體>………………………………....62
4-3最適固定化條件探討…………………………………………...62
4-3.1不同PTMS與TMOS比例之影響……………………….62
4-3.2酵素添加量之影響……………………………………..…63
4-3.3水分與silane莫爾比例(R value)之影響…………………63
4-3.4前驅物水解時間之影響……………………………….….64
4-3.5添加劑之影響……………………………….…………….65
4-3.6最適固定化條件與結果……………………………….….65
4-4固定化酵素性質之探討……………………………….………..71
4-4.1固定化酵素之物理性質…………………………….….…71
4-4.2基質抑制效應…………………………….…………….…71
4-4.3固定化酵素之熱穩定性…………………………….….…72
4-4.4不同反應溫度之影響……………………………………..73
4-4.5在室溫中之儲存穩定性………………………….…….…73
4-4.6固定化酵素之重複使用性………………………….….…74
<以PVF plates為支持體>………………………….……………..……85
4-5最適反應條件………………………….………………………..85
4-5.1參與反應之plates片數對活性的影響…………………...85
4-5.2不同大小plates對活性的影響…………………….……..85
4-6最適固定化條件探討…………………………………………...87
4-6.1不同PTMS與TMOS比例之影響………………………..87
4-6.2酵素添加量之影響……………………………………..….87
4-6.3 R值對固定化酵素之影響………………………………...88
4-6.4前驅物溶液水解時間之影響………………………….….88
4-6.5添加劑之影響……………………………….…………….88
4-6.6最適固定化條件與結果……………………………….….89
4-7固定化酵素基本性質的探討………………………….………..95
4-7.1固定化酵素之物理性質…………………..………….…...95
4-7.2基質抑制效應…………………………….…………….…95
4-7.3固定化酵素之熱穩定性…………………………….….…96
4-7.4不同反應溫度之影響………………………….…….……97
4-7.5室溫中之儲存穩定性………………………….…….……97
4-7.6固定化酵素之重複使用性………………………….….…97
<利用油相懸浮法製備溶膠凝膠顆粒>……………………….……....108
4-8 最適製備條件探討……………………….…………………...108
4-8.1 不同pH值之影響……………………….……………...108
4-8.2 轉速對活性的影響……………………….……………..108
4-8.3 R值對活性的影響……………………….……………....109
第五章 結論...……………………………………………………….....113
參考文獻………………………………………………………………..115
附錄………………………………………………………………………………118
表目錄
表2-1脂肪分解酵素能催化的反應……………………………………15
表2-2以溶膠凝膠法包埋生物觸媒之範例……………………………24
表2-3利用溶膠凝膠法製作光學及電化學生物感測器之範例………25
表4-1海藻酸鈣膠體圓珠之BET測量結果……………………………71
表4-2 PVF plates之BET測量結果…………………………………….95
表4-3不同轉速之溶凝膠體平均粒徑………………………………....108
表4-4不同R值之膠體平均粒徑……………………………………...109
圖目錄
圖2-1青黴素的結構……………………………………………………....4
圖2-2青黴素醯胺水解青黴素之反應………………………………...5
圖2-3固定化方式分類…………………………………………………...9
圖2-4海藻酸不同形式之長鏈聚合物…………………….……………11
圖2-5海藻酸鈣之結構………………………………………………….11
圖2-6脂肪分解酵素催化水解三甘油酯之反應……………………….13
圖2-7溶膠凝膠聚合過程……………………………………………….18
圖2-8酵素-載體間非共價鍵結之多點作用力示意圖………………....26
圖2-9載體內生物分子被包埋之模式………………………………….26
圖3-1製備海藻酸鈣膠體圓珠裝置圖………………………………….34
圖3-2醋酸香葉酯標準品之檢量線…………………………………….40
圖3-3不同自由酵素量催化生成醋酸香葉酯之反應………………….41
圖3-4自由酵素催化醋酸香葉酯反應之比活性……………………….42
圖3-5 GC分析圖譜……………………………………………………..43
圖4-1青黴素醯胺自由酵素濃度與活性的關係…………………….46
圖4-2不同型式前驅物對活性的影響…………………..……………...47
圖4-3不同MTMS/TMOS比例對活性的影響………….……………..48
圖4-4未經過溶膠凝膠處理的海藻酸鈣圓珠SEM圖………………...52
圖4-5經過溶膠凝膠處理的海藻酸鈣圓珠表面結構SEM圖………...53
圖4-6經過溶膠凝膠處理之海藻酸鈣圓珠剖面結構SEM圖………...54
圖4-7反應溫度對活性的影響………………………………………….55
圖4-8 pH值對活性的影響……………………………………………....56
圖4-9溫度穩定性(在各溫度下放置1小時後,於30℃測殘餘活性)
…………………………………………………………………....57
圖4-10溫度穩定性(放置55℃下不同時間後,於30℃測殘餘活性)
…………………………………………………………………..58
圖4-11酵素在固定化前後於室溫下之儲存穩定性…………………...59
圖4-12重複使用性……………………………………………………...60
圖4-13不同酵素包埋濃度之影響……………………………………...61
圖4-14 PTMS與TMOS比例對固定化酵素活性的影響……………...66
圖4-15酵素添加量對固定化酵素活性的影響………………………...67
圖4-16 R值對固定化酵素活性的影響………………………………...68
圖4-17前驅物水解時間對固定化酵素活性的影響…………………...69
圖4-18酵素液與PVA體積比對固定化酵素活性的影響……………..70
圖4-19以海藻酸鈣膠體圓珠為支持體包埋脂肪分解酵素之表面及剖面SEM結構圖…………………………………………………75
圖4-20香葉醇對固定化前後酵素之抑制效應………………………...76
圖4-21醋酸對固定化前後酵素之抑制效應…………………………....77
圖4-22固定化前後酵素之熱穩定性 (在各溫度下放置2小時)……...78
圖4-23固定化前後酵素之熱穩定性 (40℃下放置不同時間)………..79
圖4-24自由酵素與固定化酵素放置於正己烷溶液中(40℃不同時間)
…………………………………………………………………..80
圖4-25自由酵素與固定化酵素放置於含醋酸(15 mM)之正己烷溶液
(40℃不同時間).………………………………………………..81
圖4-26不同反應溫度對活性之影響…………………………………...82
圖4-27固定化前後酵素在室溫中的儲存穩定性……………………...83
圖4-28固定化酵素之重複使用性……………………………………...84
圖4-29 PVF plates片數對活性的影響…………………………………86
圖4-30 PTMS與TMOS比例對活性的影響…………………………...90
圖4-31酵素添加量對活性的影響……………………………………...91
圖4-32 R值對固定酵素活性的影響…………………………………...92
圖4-33前驅物溶液水解時間對活性的影響…………………………...93
圖4-34酵素液與PVA體積比對活性的影響…………………………..94
圖4-35未經過溶膠凝膠程序之PVF plates SEM圖…………………..98
圖4-36經過溶膠凝膠程序之PVF plates SEM圖………………..……98
圖4-37香葉醇對固定化酵素之抑制效應……………………………...99
圖4-38醋酸對固定化酵素之抑制效應……………………………….100
圖4-39固定化酵素之熱穩定性(在各溫度下放置2小時)……………101
圖4-40固定化酵素之熱穩定性(40℃下放置不同時間)……………..102
圖4-41自由酵素與固定化酵素放置於正己烷溶液中(40℃不同時間)
………………………………………………………………..103
圖4-42自由酵素與固定化酵素放置於含醋酸(15 mM)之正己烷溶液中 (40℃不同時間) ……………………………………………....104
圖4-43不同反應溫度之影響………………………………………….105
圖4-44固定化酵素在室溫中之儲存穩定性………………………….106
圖4-45固定化酵素之重複使用性…………………………………….107
圖4-46不同pH值對活性的影響……………………………………..110
圖4-47不同轉速對活性的影響……………………………………….111
圖4-48不同轉速之粒徑分佈………………………………………….111
圖4-49 R值對活性之影響…………………………………………….112
圖4-50不同R值之粒徑分佈…………………………………………112
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