臺灣博碩士論文加值系統

本研究主要係以Monascus sp.發酵蝦蟹殼水產廢棄物，生產符合具有安全、有效及無污染等特點的環保生物制劑為目的，並探討其較適生產條件、生化性質及抑制機制等等相關之研究。
實驗結果，選擇出最具抑制活性並最節省成本培養之菌株，即Monascus 31499真菌抑制劑之較適生產條件培養基中含有0.l% K2HPO4 、0.05% MgS04 ．7H20 、0.001﹪FeSO4．7H2O 、0.3﹪NaNO3 、0.05﹪KCl 、0.l% 酵母萃出物、0.l% 聚蛋白、1% SCSP；培養條件為pH 7、25℃、4 days、100 ml/250ml三角錐瓶，針對抑制Fusarium oxysporum，其活性為0.35U/ml；對各種微生物之抑制測定結果Lactobacillus acidophilus CCRC 10695、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CCRC 10699 、M1001和W113則具有較明顯的抑制情形；應用於田間試驗部分，可知粗酵素液不但可抑制植物病源真菌Fusarium oxysporum生長，亦可促進植物重量的增加。而且其pH值安定性為6~8，卻不具有100℃熱安定性。然而針對抑制Fusarium oxysporum來進行顯微鏡觀察，其抑制作用機制包括了溶解菌絲之細胞壁，改變病原菌細胞表面通透性，因而造成其菌絲末端的膨大現象，且其最適反應溫度為40℃，最適反應pH為7。
以Monascus 31499所得粗酵素液，經硫酸銨沈澱、濃縮透析並於DEAE Sepharose CL-6B中，分離出分子量約為81kDa（SDS-PAGE），等電點為5.4，且其性質為之最適反應溫度為40℃，最適反應pH值為pH7，並具有幾丁質酶及蛋白質酶活性；且其幾丁質酶及蛋白質酶活性pH值穩定性為pH 6~9，仍不具有100℃熱安定性；其胺基酸成分經推算約佔樣品總量64﹪，其中以asparagine含量最高，其次為glutamine、alanine、glycine、leucine。針對幾丁質酶活性來說Fe2+可促進其活性，而Zn2+卻抑制其活性較強，而對於Hg2+及Acetone幾乎受到完全抑制；Hg2+幾乎抑制蛋白質酶活性，EDTA、Methanol ，Ethanol對兩者均具有高抑制性。而分離純化後之真菌抑制劑，可發現在稀釋五倍的濃度下，其孢子幾乎不具有發芽狀，故以此可知此真菌抑制劑具有抑制孢子生長之機制。

This thesis is a study of the utilization of shrimp shell wastes by Monascus spp. to produce antifungal substance. The purification and characterization of fungicides were described.
By resulting, we choose Monascus 31499 as the fungicide producer. That inhibitory activity（0.35U/ml）for Fusarium oxysporum was obtained when the strain was grown aerobically in a medium consisting of 1% shrimp shell wastes，0.l% K2HPO4 、0.05% MgS04 ．7H20 、0.001﹪FeSO4．7H2O 、0.3﹪NaNO3 、0.05﹪KCl 、0.l% yeast extract and 0.l% poly-peptone in 100ml medium at 25℃（pH 7）for 4 days. Besides Fusarium oxysporum ,it can also to fight the Lactobacillus acidophilus CCRC 10695、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CCRC 10699 、Pseudomonas aeruginosa M1001 and Bacillus subtilus W113 .The fungicide was stable at pH from 6 to 8,but was not stable at 100℃. The culture supernatant was tested for hyphal growth, it caused abnormal hyphal swelling on the tip of Fusarium oxysporum. However, the optimum pH was 7 and optimum temperature was 40 degree C.
The fungicide was purified from the culture supernatant of Monascus 31499 by ammonium sulfate fractionation and DEAE Sepharose CL-6B column chromatography. The purified enzyme was estimated to be 81kDa by SDS-PAGE have molecular weight.It showed chitinase activity and antifungal activity. It’s found to be an acidic protein with pI at 5.4. The optimum pH for enzymatic activity was approx.7 and the optimum temperature was 40 degree C. The enzyme was stabile at pH from 6 to 9 and 100℃ thermal stability for inhibition times less than 3 min. The activity of chtinase and protease was activated by Fe2+,but strongly inhibited by Hg2+and Acetone.

目錄
封面內頁
簽名頁
授權書 iii
中文摘要 iv
英文摘要 vi
誌謝……………………………………………………………viii
目錄 ix
圖目錄 xvi
表目錄…………………………………………………………xviii
第一章 緒言 1
第二章 文獻回顧 3
2.1 紅麴的分類 3
2.1.1 紅麴的應用 3
2.1.2 紅麴抗菌之相關文獻 7
2.2 水產廢棄物；蝦蟹殼廢棄物之利用 10
2.3 幾丁質酶 13
2.4 植物病源真菌－鐮胞菌屬（Fusarium spp.） 14
2.5 生物製劑-植物病原真菌抑制劑 16
第三章 Monascus sp.真菌抑制劑生產條件之探討及應用 20
3.1 實驗材料與方法 20
3.1.1 材料 20
3.1.2 藥品 20
3.2 實驗方法 21
3.2.1 材料來源 21
3.2.2菌株之活化及保存 21
3.2.3 樣品製備 22
3.2.4 生物分析法 ( Bioassay ) 22
3.3 真菌抑制劑生產條件之探討 23
3.3.1 前言 23
3.3.2 Sucrose的影響 23
3.3.3 Sucrose添加碳源的影響 24
3.3.4 咖啡渣的影響 24
3.3.5 培養時間 24
3.3.6 培養液體積 25
3.3.7 培養溫度 25
3.3.8 基礎培養基酸鹼值 25
3.4 抗菌活性之測定 25
3.4.1 測試菌株 25
3.4.2 樣品製備 26
3.4.3 細菌之抑制活性分析-血清盤空白紙錠之抑制測定 27
3.4.4 真菌之抑制活性分析 27
3.5 油菜芽苗疾病分析 27
3.5.1 油菜芽苗之預培養 27
3.5.2 樣品製備 28
3.5.3 測試菌株孢子液的製備 28
3.5.4 油菜芽苗疾病之分析 28
3.6 應用實驗-空心菜及小白菜之生長情形 29
3.6.1 空心菜及小白菜芽苗之預培養 29
3.6.2 樣品製備 29
3.6.3 空心菜及小白菜之栽培 29
3.7 結果與討論 31
3.7.1 Sucrose、Sucrose添加碳源以及咖啡渣的影響 31
3.7.2 培養時間的影響 36
3.7.3 培養液的體積影響 36
3.7.4 培養溫度的影響 37
3.7.5 基礎培養基酸鹼值的影響 37
3.8 Monascus 31499真菌抑制劑之較適生產條件 43
3.9 Monascus 31499真菌抑制劑對各種微生物之抑制活性.43
3.10 油菜芽苗疾病分析 44
3.11 應用實驗-空心菜之生長情形及小白菜 47
3.12 綜合討論 54
第四章 Monascus sp.之真菌抑制劑性質之探討 56
4.1 藥品 56
4.2 材料 56
4.3 粗真菌抑制劑性質之探討 56
4.3.1 粗真菌抑制劑於不同pH之穩定性探討 56
4.3.2 粗真菌抑制劑於 100℃ 之熱穩定性探討 57
4.4 粗真菌抑制劑針對不同基質活性之探討 57
4.4.1 懸浮態幾丁質 ( Colloidal chitin ) 之製備 57
4.4.2 幾丁質分解酶 ( chitinase ) 活性測定之呈色劑 58
4.4.3 幾丁質分解酶 ( chitinase ) 活性之測定 58
4.4.4 溶菌酶( lysozyme ) 活性測定之基質 59
4.4.5 溶菌酶( lysozyme ) 活性之測定 59
4.4.6 乙二醇幾丁質酶 (ethylene glycol chitinase，EGCase)活性之測定 60
4.4.7 蛋白質酶活性之測定 60
4.4.8 纖維素分解酵素活性之測定 60
4.4.9木聚醣分解酵素活性之測定 61
4.4.10 β-N-乙醯葡萄糖胺酵素活性之測 61
4.5 真菌抑制劑生物活性測定 62
4.5.1 樣品製備 62
4.5.2 測試菌株孢子液的製備 62
4.5.3 Monascus 31499真菌抑制劑之抑制實驗 62
4.5.4 Monascus 31499真菌抑制劑之最小抑制濃度實驗 62
4.5.5 Monascus 31499真菌抑制劑之抑制作用探討 63
4.5.6 Monascus 31499真菌抑制劑儲藏溫度與時間之影響 63
4.5.7 Monascus 31499不同培養天數產產生之抑制活性與酵素
活性之影響 63
4.5.8 Monascus 31499之最適反應溫度測定 64
4.5.9 Monascus 31499之最適反應pH測定 64
4.6 結果與討論 64
4.6.1 粗真菌抑制劑於不同pH之穩定性探討 64
4.6.2 粗真菌抑制劑於 100℃ 之熱穩定性探討 65
4.6.3 酵素活性之測定 65
4.6.4 Monascus真菌抑制劑之最小抑制濃度實驗 66
4.6.5 Monascus 真菌抑制劑之抑制作用機制探討 67
4.6.6 Monascus真菌抑制劑儲藏溫度與時間之影響 68
4.6.7 Monascus 31499不同培養天數產生之抑制活性與酵素活
性之影響 68
4.6.8 Monascus 31499之最適反應溫度測定 68
4.6.9 Monascus 31499之最適反應pH測定 68
4.6.7 綜合討論 76
第五章 Monascus purpureus 31499真菌抑制劑之純與分離.78
5.1 實驗材料與方法 78
5.1.1 藥品 78
5.1.2 材料 78
5.2 真菌抑制劑之純化分離 79
5.2.1 大量培養、離心 79
5.2.2 硫酸銨沈澱 79
5.2.3 DEAE Sepharose CL-6B 陰離子層析法 79
5.2.4 分子量標定與膠體（Sephacryl S-200）過濾層析法.80
5.3 酵素對不同基質之活性測定 80
5.3.1 幾丁質分解酶 ( chitinase ) 活性之測定 80
5.3.2 溶菌酶( lysozyme ) 活性之測定 80
5.3.3 乙二醇幾丁質酶 (EGCase)活性之測定 80
5.3.4 蛋白質酶活性之測定 81
5.3.5 纖維素分解酵素活性之測定 81
5.3.6木聚醣分解酵素活性之測定 81
5.3.7 β-N-乙醯葡萄糖胺酵素活性之測定 81
5.3.8酵素對Fusarium oxysporum之最小抑制濃度實驗 81
5.3.9 金屬離子及抑制劑對酵素活性之影響 81
5.3.10 酵素之最適反應溫度測定 82
5.3.11 酵素之最適反應pH測定 82
5.4 酵素生化性質之探討 82
5.4.1 胺基酸分析 82
5.4.2 電泳分析 ( SDS--PAGE ) 測定分子量 83
5.4.3 蛋白質順序之測定 83
5.4.4 等電點之測定 83
5.4.5 分離後真菌抑制劑於100℃之熱穩定性測試 84
5.4.6 分離後真菌抑制劑於不同pH 之穩定性測試 84
5.4.7 H2S04 - Phenol 法 -- 測總糖量 84
5.4.8 載玻片發芽法 84
5.5結果與討論 85
5.5.1粗酵素液的製備 85
5.5.2 離子交換管柱層析法 85
5.5.3 分子量標定與膠體（Sephacryl S-200）過濾層析法.86
5.5.4 酵素對不同基質之活性測定 86
5.5.5 酵素之純化概要 91
5.5.6 金屬離子及抑制劑對酵素活性之影響 91
5.5.7 酵素之最適反應溫度測定 91
5.5.8 酵素之最適反應pH值測定 91
5.5.9 胺基酸分析 92
5.5.10 酵素之分子量分析 92
5.5.11 蛋白質順序之測定 92
5.5.12 等電點分析 92
5.5.13分離後真菌抑制劑於100℃之熱穩定性探討 92
5.5.14分離後真菌抑制劑於不同pH值之穩定性探討 93
5.5.15 H2S04 - Phenol 法 -- 測總糖量 102
5.5.16載玻片發芽法 102
5.5.17 綜合討論 103
第六章 結論 105
參考文獻 108
圖目錄
第三章 Monascus sp.真菌抑制劑生產條件之探討及應用
圖3.1 添加不同含量sucrose對抑制率的影響 33
圖3.2 3g sucroe+1g 碳源對抑制率的影響 33
圖3.3 1.5g sucroe+1g 碳源對抑制率的影響 34
圖3.4 不含sucrose只添加1g 碳源對抑制率的影響 34
圖3.5 咖啡渣1g與咖啡渣0.5g+SCSP0.5g對抑制率的影響 35
圖3.6 不同培養天數對抑制率的影響 39
圖3.7 不同培養體積對抑制率的影響 40
圖3.8 不同培養溫度對抑制率的影響 41
圖3.9 不同基礎培養基酸鹼值對抑制率的影響 42
圖3.10 Monascus 31499真菌抑制劑對油菜苗重量影響 49
圖3.11 Monascus 31499真菌抑制劑對油菜苗長度影響 50
圖3.12 Monascus 31499真菌抑制劑對空心菜苗長度影響 52
圖3.13 Monascus 31499真菌抑制劑對小白菜苗長度影響 52
圖3.14 Monascus 31499真菌抑制劑對空心菜苗重量影響 53
圖3.15 Monascus 31499真菌抑制劑對小白菜苗重量影響 53
第四章 Monascus sp.之真菌抑制劑性質之探討
圖4.1 Monascus所生產之真菌抑制劑不同pH之穩定性探討 69
圖4.2 Monascus所生產之真菌抑制劑不同時間加熱100 ℃之穩定性探討 69
圖4.3 Monascus所生產之真菌抑制劑之最小抑制濃度探討.70
圖4.4 液態培養時對照組Fusarium oxysporum生長情形（－1μm
；400倍） 71
圖4.5 液態培養時添加真菌劑對Fusarium oxysporum影響 ..71
圖4.6 液態培養時添加真菌劑對Fusarium oxysporum影響 ..72
圖4.7 Monascus sp.所生產之真菌抑制劑儲藏溫度（25 ℃）與
時間之影響 73
圖4.8 Monascus sp.所生產之真菌抑制劑儲藏溫度（4 ℃）與
時間之影響 73
圖4.9 Monascus 31499不同培養天數產生之抑制活性與酵素活
性之影響 74
圖4.10 酵素之最適反應溫度 75
圖4.11 酵素之最適反應pH 7 75
第五章 Monascus purpureus 31499真菌抑制劑之純化分離
圖5.1 Monascus purpureus 31499真菌抑制劑之純化圖 88
圖5.2 DEAE-Sepharose CL-6B之 真菌抑制劑層析圖 89
圖5.3 Sephacryl (S-200)過濾層析圖 90
圖5.4 酵素之最適反應溫度（pH 7） 97
圖5.5 酵素之最適反應pH值（37 ℃） 97
圖5.6酵素之SDS-PAGE 98
圖5.7 純化後之真菌抑制劑等電點層析圖 99
圖5.8 真菌抑制劑純化前後之100 ℃熱安定性（pH 7） 100
圖5.9 真菌抑制劑純化前後之pH安定性（37 ℃） 101
表目錄
第二章 文獻回顧
表2.1 Monascus spp.高附加價值之應用實施例 9
表2.2 蝦蟹殼廢棄物所含高附加價值之應用之實施例 12
表2.3 拮抗微生物之種類與其防治機制 19
第三章 Monascus sp.真菌抑制劑生產條件之探討及應用
表3.1 紅麴菌株最適培養條件一覽表 30
表3.2 Monascus 31499真菌抑制劑對各種微生物抗菌活性.45
表3.3 真菌抑制劑對油菜苗生長之重量及長度的影響 51
第四章 Monascus sp.之真菌抑制劑性質之探討
表4.1 Monascus 31499生產之真菌抑制劑於不同基質活性 66
第五章 Monascus purpureus 31499真菌抑制劑之純與分離
表5.1 Monascus 31499所生產酵素於不同基質之活性 87
表5.2 Monascus purpureus 31499真菌抑制劑之純化概要.94
表5.3 各種基質對酵素活性之影響 95
表5.4 酵素之胺基酸組成 96
表5.5 稀釋不同濃度之分離純化後真菌劑對孢子之影響 102

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