臺灣博碩士論文加值系統

雞母珠毒蛋白(abrin)是從一種本土豆科植物－雞母珠(Abrus precatorius)的種子中萃取出來的，具有很強的毒性。這種毒蛋白是一種第二型核糖體抑制蛋白質(type II RIP)，由二條構造及功能均不相同的A鏈(ABRA)和B鏈(ABRB)以一對雙硫鏈相連而成。B鏈是一種親醣蛋白質(lectin)，可以辨識細胞表面的接受體，進而與之結合，並使整個毒蛋白以receptor-mediated endocytosis的方式進入細胞，而後A鏈則利用其N-糖甘鍵水解酶活性(N-glycosidase activity)，對核糖體上60S次單元體的28S rRNA之第4324位置的腺嘌呤(A4324)作用，催化其糖甘鍵水解，使得核糖體無法與轉譯延長第二因子(EF-2)有效地結合，進而抑制該細胞蛋白質生合成的功能，因而具有毒殺細胞的作用。
為了對雞母珠毒蛋白造成細胞死亡的機轉有進一步的了解，因此想探討此毒蛋白除了抑制細胞的蛋白質合成外，是否還與細胞內那些因子或蛋白質有交互作用。故本實驗室利用yeast two-hybrid的方法，以雞母珠毒蛋白A鏈作餌去尋找在細胞內有哪些蛋白能與之有交互作用。結果發現有一個蛋白會與A鏈專一性地結合，它是一種人類抗氧化蛋白(human antioxidant protein-1)，簡稱AOP-1。
目前本實驗室已經證明AOP-1是一種存在粒線體中的蛋白質，具有抗氧化活性，並推測其活性可以保護粒線體的其他蛋白免於自由基的傷害，而且也對維持膜電位的正常有貢獻。此外也發現AOP-1若失去活性，細胞中活性氧分子(ROS)會增加，進而導致細胞色素c(cytochrome c)的釋放，終而使細胞走向死亡。在體外試驗中又證實雞母珠毒蛋白A鏈會抑制AOP-1的抗氧化能力，故推測雞母珠毒蛋白除了抑制細胞的蛋白質生合成外，也會經由抑制AOP-1抗氧化活性的方式造成細胞凋亡(apoptosis)。但ABRA影響AOP-1抗氧化活性的機制還未清楚，因此，我們利用基因重組的技術，對雞母珠毒蛋白A鏈的各個部位進行系統性的刪除，將A鏈分成數個片段，並植入適當的載體，再以yeast two-hybrid assay以及pull down assay兩種方法分別探討各種A鏈片段與AOP-1的交互作用，以釐清使二者可以有交互作用的部位在何處。
在進行yeast two-hybrid assay時，我們發現A鏈的第三部位(ABRA-III)單獨存在時就足以與AOP-1結合，而且其結合能力是完整的A鏈的88.9%。而A鏈的其他部位(ABRA-I與ABRA-II)和AOP-1結合的能力，相較之下則較微弱。分析pull down assay的結果也得到相似的趨勢:若以完整的A鏈與AOP-1結合的強度值作為100%，則ABRA-III與AOP-1之結合強度高達87.5%，而ABRA-I的則只有20%。這種情形使我們進一步想了解ABRA-III與AOP-1的結合是否具有任何功能上的意義。因此進行in vitro inhibition assay，用以研究雞母珠毒蛋白A鏈各個部位對AOP-1抗氧化活性的影響。結果發現，AOP-1的活性在ABRA-III存在下，只下降了1.1%。反倒是在A鏈的第一部位(ABRA-I)存在時，會使AOP-1的抗氧化能力快速下降 (由80.1%下降到50.1%)，而其活性下降的趨勢與由完整的A鏈所造成的情形相似。此結果顯示，雞母珠毒蛋白A鏈會先以ABRA-III和AOP-1進行強而有力的結合，使得ABRA-I能與AOP-1作較持續性的結合而抑制其抗氧化的活性，也因為粒線體內產生的活性氧分子無法及時被移除，使粒線體膜電位發生變化並造成細胞色素c的釋出，終而導致細胞走向死亡。

Abrin, a toxic protein isolated from the plant Abrus precatorius, is one of the type II RIPs (ribosome-inactivating proteins) and composed of A chain and B chain. The B chain binds to a cell surface receptor, facilitating endocytosis of the whole molecule, while the A chain exhibits an RNA N-glycosidase activity, removing a specific adenine residue (A4324) from the 28S rRNA. This N-glycosidase activity results in loss of protein elongation and presumably the subsequent death of the treated cell.
In this laboratory, it had recently been demonstrated that abrin induces apoptosis by increasing the intracellular reactive oxygen species (ROS) and by releasing cytochrome c from mitochondria to cytosol. To further investigate these intracellular effects, yeast two-hybrid system was used to search for abrin- interacting proteins that may be potentially involved in the cell death pathway induced by abrin. The results showed that a protein designated as antioxidant protein-1 (AOP-1) specifically interacts with abrin A-chain. It was shown that abrin A-chain interacts with AOP-1 and inactivates its antioxidant activity, leading to the appearance of intracellular ROS and hence the occurring of cell death.
To study how ABRA interacts with AOP-1 bringing about apoptosis, we examined the AOP-1 interacting sites of ABRA. There are three domains in ABRA, namely domain I, II, and III (ABRA-I, ABRA-II, and ABRA-III). The various truncated domains were cloned and expressed to obtain the truncated fragments of ABRA. Two different strategies were employed to study the interaction between various ABRA truncated proteins and AOP-1: (1) yeast two-hybrid system, and (2) pull down assay.
The results of yeast two-hybrid assay showed that ABRA-III interacted with AOP-1 resulting in the expression of lacZ and HIS3 reporter genes. The lacZ expression of this combination exhibited a b-galactosidase activity of 160 units, and was fewer than that of ABRA only in 20 units. The lacZ expression of other combination, however, exhibited low activity of b-galactosidase. In in vitro binding assay, ABRA-III also bound to AOP-1 in a similar way like ABRA did, and the AOP-1 binding intensity of ABRA-III was 87.5% of that of ABRA. To investigate the effect of ABRA-III on biological activity of AOP-1, in vitro inhibition assay was carried out to study whether the binding of ABRA-III to AOP-1 could affect the antioxidant activity of AOP-1. It was interesting to find that the presence of ABRA-III only caused 1.1% of AOP-1 inactivation, but the AOP-1 activity decreased dramatically from 80.1% to 50.1% when ABRA-I was present in the reaction mixture. From these results, we proposed that ABRA triggers cell death through binding to AOP-1 by ABRA-III and inhibiting AOP-1 by ABRA-I.

Catalog
Catalog … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
Abbreviations … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...2-3中文摘要 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..4-5
Abstract… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .6-7
Introduction… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .8-9
Materials and Methods… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 10-37
Materials … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...10-11
I. Plasmid construction … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …12-21
II. Plasmid construction (for yeast two-hybrid assay). … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .21
III. Yeast transformation… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .21-23
IV. b-galactosidase activity assay … …. … … …. … … …. … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 24-26
V. Plasmid construction (for pull down assay) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 26-27
VI. Expression of truncated ABRA fragments … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .27-34 VII. Expression of recombinant AOP-1 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .34-35 VIII. GST pull down assay … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …35-37
IX. in vitro inhibition assay … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …37
Results … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .38-42
Discussion … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...43-45
Figures … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …46-62
Tables … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...63-65
References… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 66-69

References
1. Lin, J. Y., Lei, L., and Tung, T. C. (1969) Purification of abrin from Abrus
precatorius L. Leguminoxal. J. Formosan Med. Assoc. 68, 518-521
2. Lin, J. Y., Chen, C. C., Lin, L. T., and Tung, T. C. (1969) Studies on the
toxic action of abrin. J. Formosan Med. Assoc. 68, 322-324
3. Lin, J. Y., Tserng, K. Y., Chen, C. C., Lin, L. T., and Tung, T. C. (1970) Abrin and ricin new anti-tumor substances. Nature 227, 292-293
4. Sandvig, K., Olsnes, S., and Pihl, A. (1976) Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to surface receptors of human cells. J. Biol. Chem. 251, 3977-3984
5. Olsnes, S., and Phil, A. (1973) Different biological properties of the two constituent peptide chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry 12, 3121-3126
6. Nicolson, G. L. (1974) Ultrastructural analysis of toxin binding and entry into
mammalian cells. Nature 251, 628-630
7. Benson, S., Olsnes, S., Pihl, A., Skorue, J., and Abraham, K. A. (1975)
On the mechanism of protein-synthesis inhibition by abrin and ricin.
Eur. J. Biochem. 59, 573-580
8. Hughes, J. N., Lindsay, C. D., and Griffiths, G. D. (1996) Morphology of ricin and abrin exposed endothelial cells is consistent with apoptotic cell death. Human ＆ Exp. Toxi. 15, 443-451
9. Shih, S. F., Wu, Y. H., Hung, C. H., Yang, H. Y., and Lin, J. Y. (2001) Abrin triggers cell death by inactivating a thiol-specific antioxidant protein.
J. Biol. Chem.276, 21870-21877
10. Schatz, G., and Dovverstein, B. (1996) Common principles of protein translocation across membranes. Science 271, 1519-1526
11. Hartl, F. U., Pfanner, N., Nicholson, D. W., and Neupert, W. (1989) Mitochondrial protein import. Biochem. Biophys. Acta. 988, 1-45
12. Tanudji, M., Sjoling, S., Glaser, E., and Whelan, J. (1999) Signals required for the import and processing of the alternative oxidase into mitochondria. J. Biol. Chem. 274, 1286-1293
13. Watabe, S., Hiroi, T., Yamamoto, Y., Fujioka, Y., Hasegawa, H., Yago, N.,
and Takahashi, S. Y. (1997) SP-22 is a thioredoxin-dependent peroxide reductase
in mitochondria. Eur. J. Biochem. 249, 52-60
14. Araki, M., Nanri, H., Ejima, K., Murasato, Y., Fujiware, T., Nakashima, Y.,
and Ikeda, M. (1999) Antioxidant function of the mitochondrial protein SP-22 in the cardiovascular system. J. Biol. Chem. 274, 2271-2278
15. Schulze-Osthoff, K., Bakker, A. C., Vanhaesebroeck, B., Beyaert, R., Jacob, W. A., and Fiers, W. (1992) Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by
early damage of mitochondrial functions. Evidence for the involvement of mitochondrial radical generation. J. Biol. Chem. 267,5317-5323
16. Zamzami, N., Susin, S. A., Marchetti, P., Hirsch, T., Gomez-Monterrey, I.,
Castedo, M., and Kroemer, G. (1996) Mitochondrial control of nuclear apoptosis.
J. Exp. Med. 183, 1533-1544
17. Zamzami, N., Susin, S. A., Marchetti, P., Hirsch, T., Gomez-Monterrey, I.,
Castedo, M., and Kroemer, G. (1996) Mitochondrial control of nuclear apoptosis.
J. Exp. Med. 183, 1533-1544
18. Buttke, T.M., and Sandstrom, P.A. (1994) Oxidative stress as mediator
of apoptosis. Immunol. Today 15, 7-10
19. Jacobson, M. D. (1996) Reactive oxygen species and programmed cell death.
Trends Biochem. Sci. 21, 83-86
20. Green, D. R., and Reed, J. C. (1998) Mitochondria and apoptosis. Science 281, 1309-1312
21. Funatsu, G., Taguchi, Y., Kamenosono, M., and Yanaka, M. (1988) The complete amino acid sequence of A-chain of abrin-a, a toxic protein from the seeds of Abrus precatorius. Agric. Biol. Chem. 52, 1095-1097
22. Hung, C. H., Lee, M. C., Lee, T. C., and Lin, J. Y. (1993) Primary sructure of three distinct isoabrins determined by cDNA sequencing. J. Mol. Biol. 229, 263-267
23. Hung, C. H., Lee, M. C., Chen, J. K., and Lin, J. Y. (1994) Cloning and expression of three abrin-a A chains and their mutants derived by site-specific mutagenesis in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 219, 564-569
24. Tahirov, T. H., Lu, T. H., Liaw, Y. C., Chen, Y. L., and Lin, J. Y. (1995) Crystal structure of abrin-a at 2.14 Å. J. Mol. Biol. 250, 354-367
25. Lin, S. H., Chow, L. P., Chen, Y. L., Liaw, Y. C., Chen, J. K., and Lin, J. Y.
(1996) Probing the domain structure of abrin-a by tryptic digestion. Eur. J. Biochem. 240, 564-569
26. Chen, J. K., Hung, C. H., Liaw, Y. C., and Lin, J. Y. (1997) Identification of amino acid residues of abrin-a A chain is essential for catalysis and reassociation
with abrin-a B chain by site-directed mutagenesis. Protein Eng. 10, 827-833.
27. Fields, S., and Song, O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein
interactions. Nature 340, 245-246
28. Kim, K., Kim, I. H., Lee, K., Rhee, S. G., and Stadtman, E. R. (1988) The isolation and purification of a specific “protector” protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)/O2 mixed-function oxidation system. J. Biol. Chem. 263, 4704-4711
29. Jaschke, A., Mi, H., and Tropschug, M. (1998) Human T cell cyclophilin 18 binds to thiol-specific antioxidant protein Aop-1 and stimulates its activity. J. Mol. Biol. 277, 763-769
30. Chan, L. N. L., Li, J. S., and Liu, S. Y. (1985) Differential effects of abrin on normal and tumor cells. J. Cell Physiol. 123, 132-138
31. Wei, C. H., Hartman, F. C., Pfuderer, P., and Yang, W. K. (1974) Purification and characterization of two major toxic proteins from seeds of Abrus precatorius. J. Biol. Chem. 249, 3061-3067
32. Barbieri, L., and Stripe, F. (1982) Ribosome-inactivating proteins from plants:
Properties and possible uses. Cancer Surveys 1, 489-520
33. Baluna, R., Rizo, J., Gordon, B. E., Ghtie, V., and Vitetta, E. S. (1999) Evidence
for a structural motif in toxins and intreleukin-2 that may be responsible for binding to endothelial cells and initiating vascular leak syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3957-3962
34. Baluna, R., Coleman, E., Jones, C., Ghetie, V., and Vitetta, E. S. (2000) The effect of a monoclonal antibody coupled to ricin A chain-derived peptides on endothelial cells in vitro: insights into toxin-mediated vascular damage. Exp. Cell Res. 258, 417-424