臺灣博碩士論文加值系統

當周圍神經受傷後遠端會產生固定的細胞變化，我們稱為瓦勒氏變性。與中樞神經不同，周圍神經受傷後能夠再生，主要是因巨噬細胞在受傷後迅速增加，他們除了清除會抑制axon生長的myelin外，刺激Schwann cell分裂，還會分泌 IL-1，才能讓非神經細胞分泌神經生長激素。要了解巨噬細胞如何浸潤神經及〝原住巨噬細胞〞（resident macrophage）的角色，我們建立以Freeze in situ（FIS）的大鼠坐骨神經傷害模式，以冷媒劑（-71℃）噴在1公分長的坐骨神經，將近端及遠端予以矽管保護，如此冷凍解凍五次，可全部殺死這1公分內的細胞，在受傷後不同時間以免疫細胞化學反應及電子顯微鏡觀察巨噬細胞的浸潤及免疫抗原的表現。
第一部分為原住巨噬細胞、浸潤巨噬細胞及血液內單核球的免疫抗原表現：巨噬細胞表現多種cell markers，可用以下抗體作間接免疫細胞化學反應：ED1, ED2, MHC-II(OX-6), MCH-I(OX-18), OX-1, (CD45,leukouyte common antigen), OX-42 (Complement receptor type 3), OX-35 (CD4)等，我們發現OX-6, ED2可明顯染出正常周圍神經之原住巨噬細胞。但浸潤巨噬細胞的細胞質則強烈表現ED1，尤其是正在吞噬時。OX-6及ED-2在少數較為細長的細胞表現，但在飽食後的吞噬細胞則很少表現。我們以pre-embedding方法作免疫電子顯微鏡，證實ED1免疫反應在lysosomes 及lysopahgosomes外圍，細胞形狀較為圓胖，OX-6及ED-2多在細長及多processes之細胞膜表現。因此不同免疫表現（immunophenotypes）的巨噬細胞功能可能不同。
冷凍解凍神經受傷1公分後，我們觀察12小時至7天的變化，發現巨噬細胞是由前、後端浸入而非由 epineurium外圍浸入，雖然大部份增加的巨噬細胞是由前、後端的血管內單核球演變過來，但在此冷凍受傷的模式，可見少數分裂中的巨噬細胞，它們可表現ED1或ED2，此也用BrdU標示分裂中的細胞再double labeling with ED1 or ED2的方法證實。以Phycoll-Hypaque分離出大鼠血液中單核球，再以免疫細胞化學反應發現，所有單核球皆為ED2陰性，不少的單核球（約10%）OX6陽性，更少數的單核球（約5%）ED1有不同程度的陽性。這顯示血液中的單核球進入受傷後的神經，免疫表現可迅速改變。但ED2陽性的細胞是由原住巨噬細胞移動或分裂而來，還是由血液中ED2陰性的單核球演變過來則不清楚。但這種受傷模式進入組織中的巨噬細胞少數也是可以分裂的，這在已分化的巨噬細胞是很少見的現象。
第二部份：巨噬細胞在Streptozotocin引起的糖尿病後三個月大鼠及正常大鼠在FIS後皮膚小神經內的表現：由於慢性糖尿病常引起小神經病變，我們嘗試用巨噬細胞ED1抗體，觀察正常老鼠及糖尿病鼠FIS後4至7天，皮下小神經有無巨噬細胞浸潤以及比較糖尿病鼠與正常鼠在FIS後，坐骨神經內ED1陽性細胞在2至7天的表現。我們發現表皮及真平淺層處巨噬細胞數在4至7天，並未有明顯的增加，只有在深真皮層較粗的神經才有少數ED1巨噬細胞，但數量遠比坐骨神經處少。皮下小神經雖含myelin，並不須很多的巨噬細胞浸潤。糖尿病鼠在坐骨神經FIS後2至4天時，坐骨神經內的巨噬細胞數目明顯較正常組少，這可一部份解釋為何糖尿病時神經再生較差。這可能與組織內Chemoattractant或是細胞移動所須的Adhesive molecules受到醣化（Glycosylation）失去效力有關。若每天以高壓氧2.4 大氣壓純氧治療90分鐘，治療一星期可明顯改善糖尿病鼠及正常鼠受傷後一星期時的巨噬細胞浸潤，同時可促進新血管形成。
第三部份：以頸上神經節之節後神經纖維模式觀察無髓鞘神經纖維之瓦勒式變性。我們以免疫細胞反應及電子顯微鏡觀察，切斷神經後的2、4、7天及正常無髓鞘神經。發現此處ED2，OX6陽性原住巨噬細胞密度較坐骨神經高出很多，受傷後ED1陽性細胞從原來無，變成有一些，但增加並不多。原來即不少的ED2陽性巨噬細胞則有明顯變大，電子顯微鏡可看出巨噬細胞早期（2至4天）在Basal lamina內及外皆有明顯的吞噬。早在受傷二天後Basal lamina內即有不少吞噬中的巨噬細胞，4天則可見Basal lamina外已有飽噬的巨噬細胞。但7天時，大部分Collapsed的Basal lamina內皆為Schwann cells的cytoplasm，有些Schwann cells還有少許的phagosomes。可見在無髓鞘神經纖維除少數外來的ED1巨噬細胞浸潤外，主要靠原住巨噬細胞，少部分靠Schwann cell，在很短的時間（一星期左右）即已相當程度地清除神經debris。我們再以雙重免疫細胞染色，三種抗体ED1、ED2及OX6，發現此三種抗原皆有各自的Subsets。雖然皆有Co-localized的部分。可見巨噬細胞免疫抗原表現的多樣性。ED2雖然在無髓鞘神經纖維為原住巨噬細胞的獨特抗原，但在無髓鞘神經纖維時，此類巨噬細胞仍具有吞噬作用，或許我們的重點應不只在於其吞噬的作用，其細胞素的分泌或許才是他們最大的功能。
第四部份：Chemokine in degenerating nerves：繼續研究為何單核球能迅速由血管滲出之機轉。我們先以Boyden chemotaxis chamber研究退化中的大鼠坐骨神經 (受傷後1, 2, 3, 4, 7天) 吸引單核細胞通過porous membrane的能力，發現以受傷後2-4天(第三天最多)最能吸引單核球。我們再以RT-PCR半定量測mice的五種chemokines (chemoattractive cytokines) mRNA: MCP-1, KC, IP-10, MIP-1α及RANTES，發現MCP-1 mRNA在sciatic nerve受傷後兩天達到peak，並有90倍以上增加，表現的時間也比巨噬細胞出現提早24小時，而其他chemokines如:MIP-1α及RANTES在第七天才達到很小的peak，KC (吸引中性球的chemokine)在第二天有一個小小的peak，隨即消失。KC的表現可解釋為什麼在第2至4天常可看到一些中性球，隨後便消失的現象。我們又用in situ hybridization及免疫細胞染色法證實是Schwann cell在表現。此新發現除了解釋周圍神經受傷後單核球滲出之機轉外，更重要的是解釋中樞神經系統不能再生是因無MCP-1的表現，才無法吸引大量巨噬細胞進行repair。
第五部分：中性球（Neutrophil）在Wallerian degeneration及FIS後之表現。
我們繼續研究為何單核球以MCP-1（Knock-out）mice作axotomy後，巨噬細胞仍然出現，雖然神經degeneration的程度稍慢2-3天。我們以中性球的抗體（MCA967 for rats及7/4 for mice , Serotec , UK.），發現在Axotomy後1至2天FIS處及遠端處（離受傷處0.5公分），皆有多量的中性球出現。這種炎症反應在程度及時間上，與一般的炎症反應並無不同。KC（中性球的chemokine）mRNA在第一天及第二天有一小peak的表現，約與MCP-1的表現同時，故Block 了下游，並不能完全阻斷這炎症連鎖反應（inflammatory cascades）。當然巨噬細胞的chemokine具redundancy（即還有其他MCP，如MCP-2、MCP-3或LIF等）也是因素。
第六部份：FK506有益於連續冷凍解凍五次後的異體神經移稙：
由前之實驗經由冷凍解凍後可去除所有細胞，以此種神經行異體移植，可增加成功率，若輔以FK506免疫抑制劑，除可防排斥，其另一獨立作用為促進神經再生。在移植後每日皮下注射2mg/kg FK506 二個月後發現，予藥這組，神經再生明顯較佳。在移植後二星期，比較CD4、CD8及巨噬細胞，予藥那組CD4、CD8較少，但macrophage明顯較多。前二者表示排斥反應較少，而後者表示巨噬細胞對神經再生是須要的、有助的。

Interruption of axons leads to a complex stereotyped sequence of cellular responses termed Wallerian degeneration (WD). The macrophages rapidly phagocytose and clear the myelin debris and participate in the generation of a suitable milieu for subsequent axonal regeneration. Most of the macrophages in degenerating nerves are believed to be blood borne. There was little known about the resident macrophages. Is the Wallerian degeneration a specific aseptic inflammatory reaction or just a classical inflammation with prolonged and robust monocyte reaction? To exclude the involvement of resident macrophages and mimic perfect anastomosis of a frozen nerve graft, a freeze in situ model (FIS) of injury on sciatic nerve of rats were created to study the macrophage responses during nerve injury. We use Freeze-it (-71℃) to repeatedly freeze the protected sciatic nerve over the thigh 5 times. Thus all the cells were killed. At various time points, we used immunocytochemical staining and electron microscope to evaluate the macrophage response.
Part 1: The immunophenotypes of infiltrating and resident macrophages as well as monocytes.
We observed the frozen nerve segment at various time intervals. The macrophages infiltrated the injured nerve segment through both proximal and distal ends almost in the same intensities. By immunocytochemistry with a panel of anti-macrophage monoclonal antibodies (abs), the resident macrophages showed intense staining with ED2 or OX6 Abs and negative staining for ED1 ab in adult rats. While the phagocytic macrophages are mostly ED1(+), only a small number of macrophages are either OX6 or ED2 positive. The ballooning macrophages are always ED1(+). The macrophages migrate through both ends of this froze nerve notably at 2 d post-injury (2 d) and peaked around 7 d. By immunoelectron microscopy, the immunoreaction (ir) product of ED1 was confined around lysosomes or phagosomes, while the ED2 or OX6 ir was largely on the cell surface of a sub-population of macrophages.