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研究生:黃惠足
論文名稱:經由精簡雜交及定量PCR反應鑑定可能的腫瘤抑制基因
論文名稱(外文):Identification of putative tumor suppressor genes via subtractive hybridization and real-time RT-PCR reaction
指導教授:蔡菁華
學位類別:碩士
校院名稱:中山醫學大學
系所名稱:毒理學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:其他醫藥衛生學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:98
中文關鍵詞:Real-Time PCR
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為探討肺癌病人的正常肺細胞內其基因表現在正常組織與癌組織的差異性,我們利用精簡雜交的方法(SSH)與不同表現量(differential screening)的篩選方法在正常肺組織中找到了86種基因。在這86個基因裡陸續設計出其相對的引子,並再利用Real-Time PCR的方式將挑出來的基因做定量的工作,比較其在正常組織與腫瘤組織的差異。因為市售的Real-Time PCR試劑組相當昂貴,而本實驗室的需求量相當大,所以本實驗室獨自開發出做Real-Time PCR的條件。從Real-Time PCR中觀察到有幾個基因在正常組織的表現量大於腫瘤組織,其中又以N21這個基因較為特殊,因為此基因在正常組織中的表現量相對於腫瘤組織來說是相當高的,而且此基因送去對NCBI database後發現此基因目前並沒有人研究,是一個未知的基因。針對N21基因往下做研究,利用Real-Time PCR定量的方式發現此基因在不同的病人也是正常組織的表現量高於腫瘤組織。我們希望能將N21基因的全長cDNA找出來,並嘗試利用定位雜交的方式希望能夠比較出此基因在肺正常組織與腫瘤組織塊表現的情形。

目 錄
壹、 中文摘要 6
貳、 英文摘要 7
參、 縮寫 9
肆、 前言 10
一、 肺癌流行病學及其危險因子 10
二、 肺癌的分類 11
三、 癌症形成的原因 12
四、 鑑定不同表現量的基因的方法 13
五、 精簡雜交反應的運用 14
六、 Real-Time PCR的運用 15
七、 研究動機 17
伍、 材料與方法
一、 儀器 18
二、 藥品 19
三、 方法 21
1. 萃取肺癌病人正常組織與腫瘤組織之total RNA 21
2. cDNA的合成 22
3. 菌落聚合酵素連鎖反應 24
4. Dot blot的製作 25
5. 製作Dot blot 雜交反應的具有放射性的探針 26
6. Dot blot 雜交反應 28
7. 萃取微量質體DNA 30
8. 從電泳凝膠中純化DNA 31
9. 將正常組織的精簡基因庫轉殖到SK載體中 32
10. E.coli的轉形作用(Transformation) 34
11. 定量PCR 35
12. 配製Real-Time PCR所需的SYBR GreenⅠ、ROX與2X 緩衝液 36
13. 從肺腫瘤細胞基因庫中篩選N21的全長cDNA 37
14. λ-噬菌斑聚合酵素連鎖反應 39
15. In vivo excision 39
16. 製作定位雜交反應的探針 41
17. 定位雜交反應 44
陸、 結果
一、 肺癌病人total RNA的萃取 48
二、 精簡基因庫的建立 50
三、 正常組織的精簡基因庫轉殖到SK +載體中 51
四、 篩選正常組織的精簡基因庫裡具有差異表現量的基因 52
五、 測試Real-Time PCR緩衝液的條件 55
六、 利用Real-Time PCR的方式比較正常精簡cDNA基因庫中的基因在病人的正常組織與腫瘤組織中表現的差異 61
七、 N21基因的研究 62
柒、 討論 66
捌、 圖表目錄
圖一、分析肺癌病人的total RNA 73
圖二、精簡雜交基因庫在pCRⅡ載體內的位置圖 74
圖三、N-T subtracted cDNA library結合到SK載體中 75
圖四、菌落 PCR產物分析於1﹪電泳凝膠 76
圖五、Dot blot 雜交反應 77
圖六、同一組轉漬膜分別用N-T subtracted cDNA probe與normal positive probe做雜交反應 78
圖七、不同濃度的SYBR Green做完Real-Time PCR後分析於2﹪電泳凝膠 79
圖八、2X緩衝液中的甘油(glycerol)與凝膠(gelatin)對Real-Time PCR的影響 80
圖九、不同濃度的KCl、(NH4)2SO4與甘油的2X緩衝液進行Real-Time PCR反應之後的電泳分析圖 81
圖十、不同甘油濃度做Real-Time PCR的跑膠圖 82
圖十一、利用自己配的緩衝液做Real-Time PCR 83
圖十二、真興實業的酵素加上抗體後與自己配的2X緩衝液進行Real-Time PCR反應 84
圖十三、6個來自N-T subtractive cDNA library的基因做Real-Time PCR反應後機器所做出的分析圖 85
圖十四、N21探針與噬菌斑做雜交反應 86
圖十五、噬菌斑PCR 88
表一、N-T library(normal specific library) 經過篩選的結果 89
表二、比較Quiagen kit與自己配的緩衝液做Real-Time PCR 89
表三、不同稀釋倍數的cDNA利用PLATINUM Taq DNA Polymerase做Real-TimePCR 89
表四、6個基因做一個病人的Real-Time PCR的統計表 90
表五、觀察N21在不同病人的表現情形 91
表六、與N21基因有關的分析 92
玖、附錄
附圖一、精簡雜交反應示意圖 93
附圖二、Suppression subtractive cDNA library上所外接的adaptor的限制酶切點與引子的位置圖 94
附圖三、肺腫瘤細胞基因庫的cDNA位於SK載體的位置圖 94
附圖四、引子形成dimer的情形 95
附圖五、cDNA library 插入噬菌體DNA的方向與primer相關位置圖 95
附表一、引子序列 96
拾、參考文獻 97

參考資料
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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