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研究生:洪惠玲
研究生(外文):Huey Ling Hung
論文名稱:經由抑制性精簡雜交反應鑑定可能的抑癌基因
論文名稱(外文):Identification of putative tumor suppressor
指導教授:蔡菁華
指導教授(外文):Jinghua T. Chang
學位類別:碩士
校院名稱:中山醫學大學
系所名稱:毒理學研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:其他醫藥衛生學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:102
中文關鍵詞:肺癌女性肺腺癌抑制性精簡cDNA基因庫
外文關鍵詞:differential screening
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因肺癌而造成的死亡率已經成為世界癌症死亡率的第一名。若單就台灣地區而言,肺癌的死亡率佔女性的第一位、男性第二位,究其罹患肺癌的原因,已知與抽煙及工作環境有關;但是在台灣的女性,抽煙率並不高,罹患肺癌的比率以及死亡率卻很高。過去的資料顯示女性的肺癌與廚房的油煙有關,但是近來的研究偏向與基因的異常有關。為了探求女性肺腺癌形成的可能因素,本實驗室利用一位女性肺腺癌患者之肺腫瘤組織以及鄰近的正常組織,建立了在正常組織表現比較高的抑制性精簡cDNA基因庫和在腫瘤組織表現比較高的抑制性精簡cDNA基因庫。然後,利用Differential screening的方法,篩選出可能在肺正常組織中表現比較高的特異性基因片段,再經由NCBI Blast N比對現有database中已知的基因,找出感興趣以及新的基因。在正常組織表現量比較高的抑制性精簡cDNA基因庫中,有一個N6的基因片段,在利用Real-time PCR的結果分析後發現,相對於GAPDH,N6基因在此肺腺癌病人之正常肺組織的表現量較肺腫瘤組織高約41倍。N6基因(第428~1136位置)與mouse slit2基因(第5432~6108位置)的3'-非轉譯區有89%的相似性,但與human slit2基因並不具有相似性。經由RT-PCR以及比對第四對染色體的DNA序列結果發現,N6與human slit2基因是位於前後相鄰的兩個不同基因裡。相對於GAPDH,N6基因不僅在腫瘤組織中表現量較低,且在許多人類肺癌細胞株裡表現量亦較低;有趣的是slit2的表現量在腫瘤組織,以及人類肺癌細胞株裡的表現比N6基因更低。由初步分析的結果推論,雖然N6基因在細胞中可能不會被轉譯成蛋白,但是其有可能調控了human slit2基因的表現,或者協同human slit2基因在正常組織中執行其功能,因此,當其中之一或者兩者基因皆缺失時,可能導致或促進癌化的重要因子。
壹、 中文摘要 6
貳、 英文摘要 8
參、 縮寫表 10
肆、 前言
一、肺癌之流行病學及其危險因子 12
二、肺癌的分類 12
三、肺癌的致死率 14
四、鑑定具有差異性表現量基因的方法 15
五、Human slit2 17
六、研究動機 19
伍、 材料與方法
一、儀器 20
二、藥品 21
三、檢體來源 22
四、實驗方法
1. RNA的萃取 23
2. 利用去氧核糖核酸酶除去total RNA裡的染色體DNA 23
3. 反轉錄反應 25
4. 聚合酶反應 25
5. 質體的萃取 26
6.利用差異性雜交反應篩選抑制性精簡cDNA基因庫 27
7. 定量PCR 32
8. 勝任細胞的製備 33
9. 接合反應 35
10.轉形作用 37
11.從電泳凝膠中純化DNA 37
12. T/A Cloning 38
13.3''核苷酸序列選殖 39
14.原位反轉錄聚合酶連鎖反應 40
陸、 結 果
一、建立正常組織與肺腺癌精簡基因庫 44
二、分析PCRII載體內攜帶cDNA的效率 44
三、Differential screening(差異性雜交反應篩選法) 45
四、確認正常組織精簡cDNA基因庫所挑選出來的 基因在正常組織有較高的表現量 49
五、確認N6基因與Human slit2基因並非同一基因 52
六、確認N6基因的片段序列 54
七、確認N6基因3''端的序列 55
八、利用in situ RT-PCR確認N6基因在正常 以及腫瘤組織上的表現差異量 55
九、比較N6基因、Human slit2基因以及GAPDH基因在不同細胞株的表現情形 56
十、確認N6基因的片段序列 58
柒、 討 論 59
捌、 圖表目錄
表1 House keep gene primers序列 67
表2 Dot blot hybridization製備所使用的引子序列 67
表3 確認N6 gene之 sequence所使用的引子序列 68
表4 3'' RACE所使用的引子序列 68
表5 各種引子的PCR條件 69
表6 ADVII酵素的PCR條件 69
表7 定量PCR的條件 70
表8 肺癌病人之肺癌腫瘤型態 71
表9 細胞株的細胞型態 72
表10 N6基因相對於GAPDH,在不同病人 之正常以及腫瘤組織中的表現差異量 73
表11 Human slit2基因相對於GAPDH,在不同病人之正常以及腫瘤組織中的表現差異量 76
圖1 抑制性PCR效應之簡圖 77
圖2 抑制性精簡cDNA雜交反應之簡圖 78
圖3 利用差異性篩選抑制性精簡cDNA基因庫 79
圖4 T/A Cloning(純系化) 判定insert插入的方向 N6-3''-RACE (3''-Rapid amplification of cDNA ends) 80
圖5 pCR II載體 81
圖6 pBluescript SK(+/-) phagemid載體 82
圖7 yT&A載體 83
圖8 確認total RNA的品質 84
圖9 經由菌落 PCR確認subtracted N-T cDNA library中帶有插入cDNA的菌落 85
圖10 第一組轉漬膜雜交反應的結果 86
圖11 利用差異性雜交反應篩選抑制性精簡cDNA基因庫的簡圖 87
圖12 第二組轉漬膜雜交反應的結果 88
圖13 第五組轉漬膜雜交反應的結果 89
圖14 GAPDH在正常以及腫瘤組織表現的差異量 90
圖15 確認是否有primer dimer的產生 91
圖16 用以建立精簡cDNA基因庫病人之定量PCR結果 92
圖17 Human slit2 與N6並非同一個基因 93
圖18 N6 cDNA sequence 94
圖19 確認N6基因3'-RACE產物 95
圖20 DNase處理的時間對in situ RT-PCR結果的影響 96
圖21 檢測經由DNase處理的total RNA是否含有染色體? 97
圖22 比較N6 gene、Human slit2以及GAPDH gene在不同細胞株的表現情形比較 98
圖23 比較N6 gene、Human slit2以及GAPDH gene在不同細胞株的表現情形 99
圖24 2% 電泳凝膠分析定量PCR產物 100
玖、 參考文獻 101
加藤治文編著,黃明賢;肺癌細胞型態及其臨床診斷;
長年出版社;20~42
簡靜香編譯;分子腫瘤學;藝軒圖書出版社;23~40
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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