臺灣博碩士論文加值系統

同屬於D型類人猿反轉錄病毒族群 (simian type D retroviruses) 的各反轉錄病毒RNA序列當中，發現都具備了有一簡稱為 CTE (constitutive transport element) 的特殊區域；而這個由兩個symmetry internal loop 以及一個AAGA bulge所形成的二級結構，則是在未經修飾的病毒RNA由細胞核進入細胞質之際，扮演逃避細胞核中對傳訊核糖核酸 (messenger RNA) 進行必要修飾的重要指標。
而根據過去的研究結果得知，人類細胞中會和CTE RNA有交互作用，並且可以幫助CTE RNA 運送出細胞核的寄主蛋白有RNA helicase A ( RHA )及Tip-associated protein ( TAP )這兩種蛋白。
我們由EMSA的實驗中首先證實了帶有兩個dsRBM區域的RHA1-257蛋白，其與CTE RNA的結合能力並不遜於TAP蛋白與CTE RNA間的結合表現。而RHA1-257蛋白上各別單一的dsRBM區域(dsRBM1 and dsRBM2)，在分別與CTE RNA結合時，就表現出dsRBM2與CTE RNA的結合能力明顯大於dsRBM1的結果。但是將dsRBM1胺基酸序列C端延長48個殘基之後所建構的RHA1-120刪除突變株蛋白，其與CTE RNA的結合能力卻與同時具有2個dsRBM區域的RHA1-257蛋白相差不多。而此一特別的RHA1-120刪除突變株蛋白，不僅僅會與CTE RNA結合，還會與dsRBM2蛋白藉由cooperate的方式，增強與具有12 base pairs的 RNA duplex結合能力。除此之外，我們還發現此一刪除突變株蛋白也同時具有與雙股CRE dsDNA相結合的能力。
此外，當位於RHA1-120蛋白序列上的第16、76和114這3個胺基酸被突變的話，會嚴重影響RHA1-120蛋白與雙股CRE dsDNA的結合能力；但對於與CTE RNA的結合則是影響不大。而這此結果似乎也暗示位於RHA1-120蛋白序列上牽涉到與CTE RNA和雙股CRE dsDNA相結合的胺基酸有可能是不大一樣的。

英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5
前言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7
材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13
以試管內轉錄作用 ( in vitro transcription)製備CTE-54 RNA
pGEX-TAP 61-372重組蛋白的質體構築
GST-TAP61-372重組蛋白之表現與純化
GST-RHA刪除突變株蛋白的表現和純化
MBP-RHA刪除突變株蛋白的表現和純化
蛋白質濃度定量
RNA之5’端γ-32P標定
TAP以及RHA不同刪除突變株蛋白與CTE-54 RNA結合能力之分析( EMSA )
結果
一、CTE-54 RNA與TAP和RNA helicase A蛋白間的結合分析
TAP重組蛋白質的表現和純化．．．．．．．．．．．．．19
RNA helicase A (RHA)重組蛋白質的表現和純化．．．．．．21
TAP61-372以及RHA1-257重組蛋白皆分別可與CTE-54 RNA相結合．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23
二、CTE-54 RNA與不同RHA1-257刪除突變株蛋白的結合能力分析
帶有dsRBM區域的RHA1-257刪除突變株蛋白，皆能與CTE-54 RNA相互結合．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 25
位於RHA蛋白序列上第152至180之間數個帶有負電荷的胺基酸，有可能是造成GST-RHA1-180刪除突變株蛋白與CTE-54 RNA間結合能力變弱的因素．．．．．．．．．．．．．．．．．28
僅僅具有單一dsRBM區域序列的RHA1-257刪除突變株蛋白(MBP-RHA1-72 and MBP-RHA180-257)，並不具有相同的CTE-54 RNA結合能力．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30
將dsRBM1胺基酸序列上的第54個胺基酸Lysine突變後，會嚴重破壞GST-RHA1-120蛋白與CTE-54 RNA間的結合能力．．．．31
三、GST-RHA1-120和MBP-RHA180-257刪除突變株蛋白與不同的核甘酸結合能力之分析
GST-RHA1-120和MBP-RHA180-257可藉由in trans的方式增強與雙股RNA間的結合能力．．．．．．．．．．．．．．．．．． 34
GST-RHA1-120重組蛋白不僅會與CTE-54 RNA結合，還會與雙股的Hairpin CRE DNA結合．．．．．．．．．．．．．．．．．38
會自行形成雙股DNA的palindrome wCRE DNA會與GST-RHA1-120刪除突變株蛋白相結合．．．．．．．．．．．．．．．．． 40
數個位於GST-RHA1-120重組蛋白上的單一點突變株蛋白，對於與雙股CRE DNA的結合能力有重大影響．．．．．．．．．．．． 43
附錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 47
討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 48
參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 51

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