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研究生:李孟哲
論文名稱:純菌株對於多環芳香探清化合物-奈、菲分解能力之研究
指導教授:盧至人
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:環境工程學系
學門:工程學門
學類:環境工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:135
中文關鍵詞:生物復育奈比活性值
外文關鍵詞:naphthalenebioremediationspecific enzyme activity
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摘要
本研究由以奈和菲為基質長期馴養之化學衡定器(Chemostat)中分離出純菌,以PAHs中的雙環分子奈(Naphthalene)及三環分子菲(Phenanthrene)作為研究主化合物,進行各純化菌株的Naphthanene oxygenase比活性值的表現、生長曲線特性、奈降解效率情況、中間產物的差異、呼吸儀測試和環境因子探討,藉此比較各純化菌株以瞭解其對於降解PAHs特性和差異,期可較精確的推估土壤採生物復育的效果。
實驗將所分離出純菌株三株純菌株以16S rRNA進行鑑定,其結果分別為Comamonas testosteroni、Rhodococcus ruber、Serratia marcescens。從實驗求得三株純化馴化菌的Km、Vmax 、Y、k值和 k/Y值。對於Naphthanene oxygenase動力學參數,Km值分別為0.26、0.19和0.24 mmole;Vmax值分別為0.00047、0.00084和0.00056 mmole/min。對於各菌株降解奈的Y值分別為0.77、0.63和0.87;k值分別為0.35、和0.29和0.31 hr-1以及k/Y值分別為0.45,0.47和0.35 hr-1。在呼吸儀測試中對於各菌株的總耗氧量和理論耗氧量比值,在以奈(溶解態)為基質時分別為0.77、0.66、和0.91;奈顆粒(結晶狀態)時為基質分別為0.29、0.97和0.87和以菲為基質時分別為0.01、0.08和0.02,實驗結果可知三株菌能將奈有效的礦化而對於菲卻不行。環境因子對各純化菌株影響實驗,得知各菌株於微酸性(pH=6.5)水相環境中、較高溫度(34℃)且氮源為銨態氮的型態時較有利於生長。環境中氧氣的供應量對於Comamonas testosteroni是非常的敏感,而對於Rhodococcus ruber則無明顯之影響性。。
關鍵字:奈、生物復育、Naphthanene oxygenase比活性值。
ABSTRACT
The objective of this study was to assess the biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by the acclimated bacteria. This study focused on the rate of biodegradation、the growth rate、the specific enzyme activity、the oxygen uptake rate and environmental factors for PAHs biodegradation.
Three acclimated PAHs-degrading strains,Comamonas testosteroni,Rhodococcus rubber and Serratia marcescenswere,were isolated from a chemostat,which was continuously fed with naphthalene and phenanthrene as the substrates. In the specific enzyme activity tests,the experimental results indicated that the value of Km were 0.26、0.19 and 0.24 μmole;the value of Vmax were 0.00047、0.00084 and 0.00056 μmole/min for these three species,respectively. In the biodegradation rate and growth rate tests,experimental results indicated that the value of Y were 0.77、0.63 and 0.87;the value of k were 0.35、0.29 and 0.31 hr-1 and the value of k/Y were 0.45,0.47 and 0.35 hr-1. for these three species respectively. The ratios of the theoretical oxygen demand to the experimental oxygen demand obtained from a respirometer with soluble NAP as the substrates were 0.77、0.66、and 0.91 for these three species,respectively. However the ratios were 0.29、0.97 and 0.87 for these three species,respectively when coystal NAP was the substrate.When phenanthrene was used as the substrates,the ratios were 0.01、0.08 and 0.02 for these three species,respectively. For environmental factors stady,the experimental results indicated that these three acclimated degrader grew batter in the temperature at 34℃ and pH at 6.4,especially using ammonium as the nitrogen sources.
Keyword : naphthalene,bioremediation,specific enzyme activity
目錄
中文摘要……………………………………………………………Ι
英文摘要…………………………………………………………ΙΙ
目錄………………………………………………………………ΙΙΙ
圖目錄………………………………………………………VΙΙΙ
表目錄……………………………………………………………XΙΙΙ
第一章 前 言………………………………………………1
1-1研究緣起………………………………………………1
1-2研究內容………………………………………………2
第二章 文獻回顧……………………………………………3
2-1多環芳香族碳氫化合物污染及其危害…………………3
2-1-1多環芳香族碳氫化合物特性…………………………3
2-1-2多環芳香族碳氫化合物的產生…………………………3
2-1-3多環芳香族碳氫化合物在環境的分布和含量……………7
2-1-4多環芳香族碳氫化合物的危害………………………11
2-2微生物分解多環芳香族碳氫化合物之特性………………13
2-2-1微生物降解多環芳香族碳氫化合物的通則……………13
2-2-2奈(naphthalene)和菲(phenanthrene)的降解……16
2-3奈雙氧氧化酵素…………………………………………22
2-3-1Naphthalene oxygenase結構和特性……………………22
2-3-2Naphthalene oxygenase活性測定…………………………22
2-3酵素的動力學…………………………………………27
第三章 實驗材料與方法………………………………32
3-1實驗藥品……………………………………………32
3-1-1馴養基質和其他藥品………………………………32
3-1-2蛋白質測定藥品……………………………………32
3-1-3無機營養鹽………………………………………33
3-1-4培養基……………………………………………33
3-1-5實驗用水…………………………………………34
3-2實驗菌種………………………………………………36
3-2-1菌種來源…………………………………………36
3-2-2 Chemostat馴養………………………………36
3-2-3菌種保存方法……………………………………36
3-3主要實驗設備…………………………………………38
3-3-1液相色層層析儀…………………………………38
3-3-2分光光度計………………………………………38
3-3-3氣泡式呼吸儀……………………………………39
3-3-4酸鹼度計和離心機………………………………40
3-3-5無菌操作台…………………………………………41
3-4實驗準備與分析條件建立……………………………43
3-4-1各藥品貯備液配製…………………………………43
3-4-2菌種增殖和馴養……………………………………43
3-4-3菌體吸光度和乾重建立……………………………44
3-4-4奈和可能之中間產物的定性、定量條件之建立…………………………………………………………………44
3-4-4呼吸儀細胞元件校正………………………………44
3-4-5呼吸儀系統測試……………………………………47
3-5實驗流程………………………………………………48
3-5-1Naphthalene oxygenase比活性值偵測和naphthalene dihydrodiol的生成觀察………………………………48
3-5-2水相批次實驗流程………………………………51
3-5-3中間產物偵測……………………………………54
3-5-4呼吸儀實驗流程…………………………………55
第四章 結果與討論 …………………………………………58
4-1實驗條件之建立與準備……………………………58
4-1-1奈和可能中間產物的HPLC定性、定量條件之建立……58
4-1-2光譜分析背景測試………………………………60
4-1-3菌體吸收度(OD500)和乾重關係……………………60
4-1-4呼吸儀細胞元件校正………………………………64
4-2菌種鑑定………………………………………………68
4-2-1各純化菌株16S rRNA的鑑定結果………………68
4-2-2各純化菌株特性觀察………………………………69
4-3 各菌株比較 ……………………………………………73
4-3-1Naphthalene oxygenase比活性值……………73
4-3-1-1不同基質馴化後的naphthalene oxygenase比活性值…………………………………………………………73
4-3-1-2 Cis-1R,2S-di-hydroxy-1,2-dihydronaphthalene的監測………………………………………………………………82
4-3-1-2各純化菌株降解奈動力學的探討…………………………………………………………………85
4-3-2各菌株菌體生長曲線與奈降解狀況……………90
4-3-2-1未馴養或以奈馴養之各菌株菌體生長曲線…………………………………………………………90
4-3-2-2以奈顆粒(結晶狀)為碳源各菌株菌體生長曲線………………………………………………………………95
4-3-2-3未馴養或以奈馴養之各菌株奈降解狀況…………………………………………………………………97
4-3-2-4奈的降解與菌體生長之相關性………………………103
4-3-2-5各菌降解奈時中間產物的偵測………………………107
4-3-4各菌株對於PAHs中三環的菲(phenanthrene)和恩(anthracene)的降解………………………………………109
4-3-4各菌株呼吸儀偵測……………………………………112
4-4環境因子對各純化菌株影響……………………………117
4-4-1環境因子影響-溫度……………………………………117
4-4-2環境因子影響-pH值……………………………………120
4-4-3環境因子影響-氮源型式………………………………122
4-4-4 環境因子影響-氧氣濃度………………………………124
第五章結論與建議…………………………………………………127
5-1結論………………………………………………………127
5-1建議………………………………………………………129
參考文獻……………………………………………………130
圖目錄
圖2-1 環境中PAHs的產生和分佈…………………………………… 8
圖2-2 海洋PAHs來源和循環………………………………………… 9
圖2-3 苯被氧化酵素分解的程序………………………………… …15
圖2-4 細菌好氧下降解奈的途徑………………………………… …20
圖2-5 細菌好氧下降解菲途徑……………………………………21
圖2-6 Naphthalene oxygenases電子傳遞鏈和結構……………23
圖2-7 奈被氧化酵素降解特性……………………………………25
圖2-8 Michaelis-Menten 動力式圖的意義……………………31
圖3-1 Chemostat裝置圖…………………………………………37
圖3-2 呼吸儀設備圖………………………………………………42
圖3-3 呼吸儀細胞元件校正裝置圖………………………………46
圖3-4 酵素活性偵測流程圖………………………………………50
圖3-5 水相批次流程圖……………………………………………53
圖3-6 呼吸儀實驗流程圖…………………………………………57
圖4-1 奈、水楊酸、龍膽酸和茶兒酚的檢量線…………………59
圖4-2 光譜分析背景測試…………………………………………61
圖4-3 菌體吸收度和乾重關係……………………………………63
圖4-4 呼吸儀系統測試……………………………………………69
圖4-5 各菌株SEM照片……………………………………………73
圖4-6 未馴養時各純化菌株降解奈的連續偵測值-偵測方式為在分光光度計cells內,加入菌液(以磷酸鹽緩衝液(0.05 M,pH=7)調整菌液濃度為OD500=0.125)3mL和溶於ethanol的奈(10mM)0.02ml,在波長為276 nm下偵測。…………………………………………76
圖4-7 各菌株經奈馴化後降解奈的連續監測值-偵測方式為於分光光度計cells內,加入菌液(以磷酸鹽緩衝液(0.05 M,pH=7)調整菌液濃度為OD500=0.125)3mL和溶於ethanol的奈(10mM)0.02ml,在波長為276 nm下偵測。…………………………………………77
圖4-8 各菌株經水楊酸馴化後降解奈連續監測值-偵測方式為於分光光度計cells內,加入菌液(以磷酸鹽緩衝液(0.05 M,pH=7)調整菌液濃度為OD500=0.125)3mL和溶於ethanol的奈(10mM)0.02ml,在波長為276 nm下偵測。…………………………………………78
圖4-9 各菌株經奈加水楊酸馴化後奈連續監測值-偵測方式為於分光光度計cells內,加入菌液(以磷酸鹽緩衝液(0.05 M,pH=7)調整菌液濃度為OD500=0.125)3mL和溶於ethanol的奈(10mM)0.02ml,在波長為276 nm下偵測。…………………………………………79
圖4-10 未馴養時各純化菌株naphthalene dihydrodiol連續偵測值-偵測方式為於分光光度計cells內,加入菌液(以磷酸鹽緩衝液(0.05 M,pH=7)調整菌液濃度為OD500=0.125)3mL和溶於ethanol的奈(10mM)0.02ml,在波長為262 nm下偵測。…………………83
圖4-11 各菌株速率對濃度做圖得到的Michaelis-Menten圖…88
圖4-12 各菌株速率除於濃度對濃度做圖得到Eadie-Hofstee圖89
圖4-13 未經奈馴養各純菌株的生長曲線和生長速率-實驗各菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後取出供實驗使用,其生長的條件為奈15 mg/L 和無機營養鹽。………………………………92
圖4-14 經奈馴養的各純菌株的生長曲線和生長速率-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後取出,以奈馴養24小時後再取出供實驗使用,其生長的條件為奈15mg/L 和無機營養鹽。93
圖4-15 各純菌株經奈馴養後以奈顆粒為碳源的生長曲線和生長速率-各實驗純菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後,取出以奈馴養24小時後再取出供實驗使用,其生長的條件為奈(顆粒狀)50 mg/L 和無機營養鹽。……………………………………………96
圖4-16 未經奈馴養的各純菌株對於奈的降解曲線和降解速率-各實驗純菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後取出供實驗使用,其生長的條件為奈15mg/L和無機營養鹽。…………………99
圖4-17 經奈馴後各純菌株對於奈的降解曲線和降解速率-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後取出以奈馴養24小時,後再取出供實驗使用,其生長的條件為奈15mg/L 和無機營養鹽。……… …………………………………………………………100
圖4-18各純菌株以菲顆粒為碳源的生長曲線-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時取出供實驗使用,其生長的條件為菲(顆粒狀)50 mg/L 和無機營養鹽。………………………110
圖4-19各純菌株以恩顆粒(恩結晶狀)為碳源的生長曲線-實驗各菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時後供實驗使用,其生長的條件為恩(顆粒狀)50 mg/L 和無機營養鹽。………………111
圖4-20 以奈(溶解態)為生長碳源的呼吸儀試驗-奈濃度為20 mg/L,添加菌量為OD500=0.5。(上圖為好氧累積圖、下圖為攝氧速率圖)……………………………………………………………………114
圖4-21 以奈顆粒(非溶解態)為生長碳源的呼吸儀試驗-奈濃度為50 mg/L,添加菌量為OD500=0.5。(上圖為好氧累積圖、下圖為攝氧速率圖)………………………………………………………………115
圖4-22 以菲顆粒為生長碳源的呼吸儀試驗-奈濃度為50 mg/L,添加菌量為OD500=0.5。(上圖為好氧累積圖、下圖為攝氧速率圖)…116
圖4-23 溫度對各純化菌株生長影響-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時,取出以奈馴養24小時後再取出供實驗使用。生長條件為奈=15 mg/L和無機營養鹽。偵測時間為震盪培養18小時後偵測其OD500值。…………………………………………119
圖4-24 pH值對各純化菌株生長影響-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時,取出以奈馴養24小時後再取出供實驗使用。生長條件為奈=15 mg/L和無機營養鹽。偵測時間為震盪培養18小時後偵測其OD500值。…………………………………………121
圖4-25 氮源型態對各純化菌株生長影響-各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時,取出以奈馴養24小時後再取出供實驗使用。生長條件為奈=15 mg/L和無機營養鹽。偵測時間為震盪培養18小時後偵測其OD500值。…………………………………………123
圖4-26 氧氣濃度對各純化菌株生長影響-各各實驗菌株為在Nutrient Broth培養基上生長24小時,取出以奈馴養24小時後再取出供實驗使用。生長條件為奈=15 mg/L和無機營養鹽。偵測時間為震盪培養18小時後偵測其OD500值。……… …………………126
表目錄
表2-1 PAHs物化特性與毒理特性……………………………………4
表2-2 各地區奈偵測值………………………………………………10
表2-3 奈及菲對人體毒理特性………………………………………12
表2-4 能分解奈和菲微生物…………………………………………19
表3-1 無機營養鹽配方………………………………………………35
表4-1 菌體吸收度和乾重關係實驗結果……………………………62
表4-2 細胞校正係數…………………………………………………66
表4-3 各菌株的16S rRNA鹼基續列………………………………70
表4-4 各菌株的16S rRNA鹼基續列與GeneBank比對的結果……71
表4-5 各菌株以不同基質馴化後的naphthalene oxygenase比活性值………………………………………………………………………80
表4-6 各濃度下各菌株的初始速率結果……………………………87
表4-7 未馴養或以奈馴養之各菌株菌體生長之比較………………94
表4-8 未馴養和以奈馴養之各菌株奈降解之比較………………102
表4-9 奈降解效率與菌體生長之相關性…………………………105
表4-10各菌株中間產物的量測結果………………………………108
文獻回顧
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