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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:黃彥杰
研究生(外文):Yen-Chien Huang
論文名稱:△5-3-酮基類固醇異構酵素突變株化學修飾之研究
論文名稱(外文):Study of Chemical Modification of △5-3-Ketosteroid Isomerase Mutants
指導教授:李耀坤李耀坤引用關係
指導教授(外文):Yaw-Kuen Li
學位類別:碩士
校院名稱:國立交通大學
系所名稱:應用化學系
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:68
中文關鍵詞:酮基類固醇螢光胜肽圖譜
外文關鍵詞:Ketosteroid isomerasefluorescencepeptide mapping
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Pseudomonas testoteroni 中發現的酵素 △5-3-酮基類固醇異構酵素 (KSI,EC 5.3.3.1) 能以擴散速率控制,立體選擇及立體保留的方式將 △5-3-酮基類固醇轉變成 △4-3-酮基類固醇。其催化反應中,Tyr-14 扮演 general acid,Asp-38 扮演 general base。當類固醇進到酵素活性區時會對 Tyr-14 的螢光產生淬息現象,但因螢光強度不高而靈敏度不夠,無法使用於晶片檢測上。所以,為了在酵素活性區內修飾一螢光物質以增大其螢光強度,分別以定點突變方式設計了半胱胺酸於胺基酸序列 54、55、82 的位置,再將此突變株與 5,5’-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 及螢光物質 IANBD ester (I-9) 及 1,5-IAEDANS (I-14) 反應。結果發現 DTNB 可修飾於所引入的半胱胺酸上,而上述兩類螢光物質除了可以修飾在 Cys-54 外,並無法進入酵素活性區深處與 Cys-82 反應。反之,以胜肽圖譜法分析螢光物質所修飾的胺基酸位置發現,I-14 可修飾在胺基酸 Asp-38 上。這是因為 Asp-38 位於酵素活性區疏水環境中親核性變強,以致於可與螢光物質反應的結果。而 I-9 修飾於胺基酸後螢光團會斷裂,導致無法觀測 I-9 的紫外-可見光及螢光變化。以 DTNB 和 I-14 修飾後的 KSI 活性至少降低了 103 倍,而由類固醇結合能力的 KD 值分析,修飾後的 KSI 與類固醇的結合能力變差。 DTNB 修飾在 Cys-82 時,紫外光吸收剩下 55 ﹪,且由 324 nm 藍位移至 318 nm;DTNB 修飾在 Cys-54 時,紫外光吸收剩下 50 ﹪,沒有藍位移現象。I-14 修飾在 Asp-38 上時,螢光由 498 nm 藍位移至 452 nm (Y55F/Y88F) 及 464 nm (Y55F/F82C/Y88F),螢光強度也分別增強 3.4 倍 及 3.7 倍,而I-14 同時修飾在 Asp-38 與 Cys-54 上時,螢光無藍位移產生,但螢光強度約增強了 6 倍。此外,利用設計在酵素表面的半胱胺酸可使 KSI 與奈米金條反應而固定在奈米金條上,此現象或可應用於開發類固醇檢測試片或晶片。

△5-3-Ketosteroid isomerase (KSI, EC 5.3.3.1) of Pseudomonas testoteroni promotes the highly efficient isomerization of △5-3-Ketosteroids to △4-3- Ketosteroids by a direct and stereospecific transfer of the 4β-proton to the 6-β-position. Asp-38 and Tyr-14 function as the general base and the general acid of the catalytic reaction, respectively. The fluorescence intensity of Tyr-14 can be quenched when enzyme binds with some steroids such as 19-nortestosterone. Since the intrinsic fluorescence intensity of KSI is too weak to apply on biochip for steroid detection, two dyes (I-14 and I-9) are hence selected as labeling agents which are potentially useful for improving fluorescent property of KSI. KSI mutants, Y55F/Y88F, Y55F/Y88F/F54C and Y55F/Y88F/F82C, which are designated as Y14only, 54C, and 82C, respectively, were constructed for labeling study. The dye I-14 can only performed a single-labeling on Y14only and 82C, whereas a double-labeling can be found when 54C was incubated with I-14. Studies from peptide mapping and tandem mass spectrometry of the labeled KSI mutants revealed that both the newly recruited cystein residue and Asp-38 in the mutant can be modified. The modification on Asp-38 can be explained by assuming its unusual nucleophilicity resulting from the highly hydrophobic environment. The outcomes of labeling with I-9 were similar to those of with I-14. However, interestingly, on the I-9 labeled mutants, the corresponding chromophoric moiety can be further hydrolyzed. All of these observations were confirmed both by ESI-MS and UV-spectroscopy analysis of proteins. The fluorescence intensity of I-14-labeled mutants is enhanced, whereas for I-9-labeled mutants, the fluorescence data were not reliable owing to the continuous decomposition of chromophoric group of I-9. Both the catalytic activity and steroid binding ability of mutants labeled with DTNB or I-14 decrease significantly. Further study will be performed on improving the recognition of steroid by this group of KSI mutants.

目錄
中文摘要 ………………………………………………………………….. i
英文摘要 ………………………………………………………………….. iii
目錄 ………………………………………………………………….. v
圖表目錄 ………………………………………………………………….. vii
一、緒論………….………………………………………………………………. 1
1.1 類固醇簡介…………………………………………………………. 1
1.2 類固醇的醫學應用及其副作用……………………………………. 1
1.3 △5-3-酮基類固醇異構酵素 (KSI) 簡介………………………….. 3
1.4 KSI 與類固醇的反應機制…………………………………………. 4
1.5 KSI 螢光光譜及其與類固醇結合能力之研究……………………. 6
1.6 研究目標……………………………………………………………. 8
二、實驗方法…………………………………………………………………….. 12
2.1 一般敘述……………………………………………………………. 12
2.2 突變株之突變與選殖………………………………………………. 12
2.3 KSI 突變酵素的純化………………………………………………. 13
2.3.1 胞內粗提液的取得及銨鹽沉澱……………………………….. 13
2.3.2 HiTrap Q 陰離子交換樹脂管柱層析…………………………. 14
2.3.3 蛋白質結晶製備……………………………………………….. 14
2.4 KSI 突變酵素濃度的決定…………………………………………. 15
2.4.1 建立蛋白質濃度檢量線……………………………………….. 15
2.4.2 測定蛋白質的濃度…………………………………………….. 15
2.5 KSI 動力學實驗……………………………………………………. 16
2.5.1 測量 KSI 活性………………………………………………… 16
2.5.2 測量 KSI 的 Km、kcat………………………………………… 16
2.6 KSI 突變酵素之紫外-可見光及螢光光譜研究…………………... 17
2.7 KSI 突變酵素與各種類固醇解離常數 (KD) 之研究…………….. 17
2.8 KSI 突變酵素與標示物質反應……………………………………. 17
2.9 將 KSI 固定於奈米金條上………………………………………... 18
2.10 利用質譜儀檢測 KSI 分子量……………………………………... 18
2.10.1 以質譜儀鑑定 KSI 分子量…………………………………… 18
2.10.2 以胜肽圖譜法 (peptide mapping) 分析化學修飾之胺基酸…. 18
三、結果與討論………………………………………………………………….. 20
3.1 KSI 各突變株建立的基本構想……………………………………. 20
3.2 KSI 突變酵素的純化………………………………………………. 21
3.3 KSI 突變酵素濃度的決定…………………………………………. 23
3.4 KSI 突變酵素與 DTNB 反應…………………………………….. 24
3.5 KSI 突變酵素與螢光物質反應情形………………………………. 30
3.5.1 螢光物質的基本性質與結構………………………………….. 30
3.5.2 酵素與螢光物質的修飾反應………………………………….. 31
3.6 KSI 動力學研究……………………………………………………. 51
3.7 KSI 突變酵素與各種類固醇解離常數(KD)之測定…………… 53
3.8 KSI固定化…………………………………………………………. 57
3.8.1 126C 酵素使用前的處理……………………………………… 57
3.8.2 KSI 與奈米金條 (Au nanorod) 反應………………………… 58
四、結論…………………………………………………………………………. 61
五、參考文獻……………………………………………………………………. 63
附錄一 …………………………………………………………………………… 64
附錄二 …………………………………………………………………………… 66
附錄三 …………………………………………………………………………… 67
圖表目錄
圖一. IUPAC 對類固醇碳鏈的命名 ……………………………………. 1
圖二. (A) KSI 3α9β 結構示意圖,(B) 活性區之疏水性示意圖……. 5
圖三. KSI 催化活性部位重要胺基酸殘基與類固醇 19-NTHS
相對位置……………………………………………………………. 5
圖四. KSI催化之反應機構………………………………………………. 6
圖五. 各突變點於酵素催化活性區的相對位置 …………………….. ….. 8
圖六. 酵素活性區中欲突變胺基酸的相對位置 (3D)………………. ….. 10
圖七. 胺基酸 Asp-32、Arg-91、Ala-125 在 KSI 表面上的位置 (3D). 11
圖八. 各突變菌株中 KSI 的誘導結果 ………………………………….. 21
圖九. HiTrap Q 陰離子交換樹脂層析圖………………………………… 22
圖十. 各突變株蛋白質的純度電泳圖……………………………………. 22
圖十一. 再結晶後的 KSI……………………….…………………………… 23
圖十二. DTNB 結構圖……………………………………………………… 25
圖十三. DTNB (50 mM Tris-HCl pH 7.5) 與 NTB (1 M NaOH) 的紫
外可見光光譜圖……………………………………………………. 25
圖十四. NTB 在不同 pH 下 OD412 nm 的曲線圖……………………….. 25
圖十五. KSI 與 DTNB 反應情形…………………………………………. 26
圖十六. Y14 only 與 DTNB 於緩衝液中反應後質譜分析圖……………. 27
圖十七. 54C 與 DTNB 於緩衝液中反應後質譜分析圖………..………… 28
圖十八. 82C 與 DTNB 於緩衝液中反應後質譜分析圖…………………. 28
圖十九. 54C 與 82C 接上 NTB 後的紫外可見光譜變化….……………. 29
圖二十. DTNB 在不同百分比異丙醇下的紫外可見光光譜變化………… 29
圖二十一. 螢光物質的結構……………………….…………………………… 31
圖二十二. 54C 與 I-14 於緩衝液中反應後質譜分析圖……………………. 32
圖二十三. 82C 與 I-14 於緩衝液中反應後質譜分析圖……..……………... 33
圖二十四. Y14 only 與 I-14 反應後質譜分析圖…………………….……… 33
圖二十五. 以 RP-HPLC 管柱分析胜肽之層析圖..………………………….. 34
圖二十六. 雙電荷 822.7 質譜峰之二次質譜分析………………………. ….. 35
圖二十七. 雙電荷 975.8 質譜峰之二次質譜分析………………………..….. 35
圖二十八. 82C、DTNB、I-14 於緩衝液中反應後質譜分析圖……………... 36
圖二十九. 82C-I14 與 DTNB 於緩衝液中反應後質譜分析圖……………... 37
圖三十. 82C-NTB 與 I-14 於緩衝液中反應後質譜分析圖………………. 37
圖三十一. 82C-I14 與 DTNB 於 5 M 尿素中反應後質譜分析圖………… 38
圖三十二. 82C-NTB 與 I-14 於 5 M 尿素中反應後質譜分析圖………….. 38
圖三十三. Y14 only 與 I-14 於 5 M 尿素中反應後質譜分析圖…………... 39
圖三十四. I-14 (1μM) 於不同異丙醇百分比下之紫外可見光光譜圖……... 41
圖三十五. Y14 only-I14,54C-I14,82C-I14 的紫外光譜圖………………... 42
圖三十六. I-14 (1μM) 於不同異丙醇百分比下之螢光光譜圖……………... 42
圖三十七. Y14 only-I14,54C-I14,82C-I14 的螢光光譜圖 (1μM)……… 43
圖三十八. 由 I-14 修飾過後 KSI 的螢光放光……………………………… 44
圖三十九. 上圖分別為 54C-I9、82C-I9、Y14 only 接上 I-9 後斷裂情形... 45
圖四十. Y-14 only-I9 標示及斷裂情形…………………………………….. 46
圖四十一. 酵素接上 I-9 後的斷裂位置示意圖……………………………… 47
圖四十二. 82C-I9D 與 DTNB 於緩衝液中反應後質譜分析圖……………. 48
圖四十三. 82C-I9D 與 I-14 於緩衝液中反應後質譜分析圖………………. 48
圖四十四. 82C-I9D 與 DTNB 於 5M 尿素中反應後質譜分析圖………… 49
圖四十五. 82C-I9D 與 I-14於 5M 尿素中反應後質譜分析圖……………. 49
圖四十六. Y14 only-I9D 的紫外可見光光光譜……………………………… 50
圖四十七. 126C 未經 DTT 處理前質譜分析圖…………………………….. 57
圖四十八. 126C 以 DTT 處理過後質譜分析圖…………………………….. 58
圖四十九. DTT 與 TCEP 結構圖……………………………………………. 58
圖五十. 原奈米金條在顯微鏡下的型態……………………………………. 59
圖五十一. 奈米金條加入 126C 後的型………………………………………. 59
圖五十二. 奈米金條在加入酵素前後的紫外可見紅外光光譜變化…………. 60
表一. 檢量線溶液…………………………………………………………. 15
表二. 各突變株之設計及實驗結果…………………………….……. ….. 20
表三. 不同比例殘基之莫耳吸收係數…………………………...……….. 24
表四. KSI 酵素與 DTNB 反應後分子量變化表……………….……… 27
表五. 螢光物之基本性質…………………..……………………….…….. 30
表六. KSI 酵素與 I-14 反應後分子量的變化…………………………. 32
表七. KSI 與 DTNB 及 I-14 的交叉反應……………………………... 36
表八. 胺基酸與受值反應對照表………………..………………...……… 41
表九. 酵素與 I-9 反應後之分子量變化………………………….……... 47
表十. 82C-I9D 與 DTNB 及 I-14 的交叉反應………………………... 47
表十一. KSI 動力學常數……………………..…………………………….. 52
表十二. KSI 的 KD、△G 及淬息百分比…………………………………. 55
表十三. KSI-I14 的 KD、△G 及淬息百分比……………………………... 56
表十四. 126C 單分子及雙分子分子量表………………………………….. 57

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