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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:徐勃曦
研究生(外文):Po-Hsi Hsu
論文名稱:以高效能液相層析/質譜法與蛋白質資料庫搜尋鑑別微生物之研究:蛋白質生物標籤效應
論文名稱(外文):Investigating the Effects of Protein Contents on Microorganism Identification by HPLC-Mass Spectrometry and Protein Database Searches
指導教授:何彥鵬
指導教授(外文):Yen-Peng Ho
學位類別:碩士
校院名稱:國立東華大學
系所名稱:化學系
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:102
中文關鍵詞:細菌電噴灑質譜術蛋白質資料庫
外文關鍵詞:esi-mslc-msbacteriadatabase
相關次數:
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能夠鑑別存在食物或水源中的微生物是相當重要的。而傳統微生物鑑別的方法相當耗時,另一個較新的方法是利用質譜分析方法來鑑別。大部分有關微生物鑑別的質譜技術的文獻是利用MALDI-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) 的方式來做,較少的部分是以LC-ESI-MS (Liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry) 的方法來做討論。我們的研究方向是利用LC-ESI-MS搭配蛋白質資料庫的搜尋比對來鑑別微生物。利用不同的樣品前處理方式如改變溶劑極性、pH值與改變萃取方法來得到微生物中的蛋白質。在不同的實驗條件下可以得到不同數目的蛋白質訊號,其中有些訊號是相同的另外有些則不同。將所得到的蛋白質質譜圖經軟體轉換得到蛋白質分子量。把得到的分子量�b3 Da輸入蛋白質資料庫 (SWISS-PORT) 去搜尋比對找出對應的微生物。雖然使用不同的前處理方式得到不同的蛋白質訊號,但是經過蛋白質資料庫的比對都能找到正確的微生物。我們也對實驗的再現性做了一系列的實驗其複製性也相當良好。從改變不同處理樣品方式所得到的實驗結果,我們知道不同的萃取溶劑能萃取出不同的生物標籤,所以我們利用以含0.1% 甲酸的70% 乙腈水溶液為萃取溶劑,對不同的細菌做分析。經過震盪萃取後離心,將上層澄清液直接打入質譜儀分析。透過所得到的質譜圖我們可以區別不同屬的細菌 (如Bacillus subtilis、Streptococuus bovis、Xanthomonas campestris與Staphylococcus aureus) 以及同屬不同種 (Streptococuus agalactiae、Streptococuus sangwis、Streptococuus bovis與Streptococcus pyogenes) 的細菌樣品。
High performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (HPLC-ESI-MS) has been employed for separation and detection of protein biomarkers from E. coli samples. LC-MS is suitable for microbial identification because it can couple on-line with sample clean-up devices and is readily amenable to automation. In this work, we have investigated the effects of sample preparation methods on the detection of bacterial proteins by LC-MS. Many factors effect the degree of variations in the protein patterns (i.e. number and mass of proteins). For example, changing the polarity as well as pH of the extraction solvent may control the number of detected proteins. It is also noted that the protein patterns can vary even when the total ion chromatography plots seem to be the same under the same preparation conditions. In spite of the variation in protein patterns, all the database search results show that the best matches come from the correct microorganism. Direct MS analysis of microorganisms has also been carried out without prior LC separation. Based on the results of the solvent effect study in the LC-MS work, a 70% acetonitrile /0.1% formic acid solution was used to extract biomarkers from Bacillus subtilis、Streptococuus bovis、Xanthomonas campestris and Staphylococcus aureus. All the spectra showed different finger print biomarkers that differentiated the microorganisms at both the genus and species levels.
目錄

論文摘要

壹、 緒論

1.1前言………………………………………………………..…………1
1.2質譜儀的發展與原理……………………………………………4
1.2.1質量分析器………………………………………….……4
1.2.2離子源的發展歷史…………………………………….…9
1.3電噴灑游離法的發展與原理…………………………….……13
1.3.1發展歷程………………………………………………...13
1.3.2反應的機制………………………………………………15
1.4高效能液相層析儀與電噴灑質譜儀的結合………………..18
1.4.1層析技術發展史的介紹…………………………………18
1.4.2高效能液相層析儀與質譜儀的結合…………………....19
1.5細菌的簡介………………………………………………………..22
1.6細菌中蛋白質萃取的方式……………………………………..25
1.7質譜技術在微生物鑑別上的應用…………………….…..…..26
1.8蛋白質資料庫的介紹…………………………………………....30
1.9論文目標……………………………………………………….….32



貳、 實驗部分……………………………………………..……33

2.1儀器裝置與藥品相關耗材及試劑……………………..…33
2.2樣品製備方法……………………………………………..…35
2.2.1樣品前處理方法………………………………...……...35
2.2.1樣品的製備…………………………………………..…38
2.3實驗步驟……………………………………...……………….41
2.3.1已知的樣品的分析…………………………..……...….41
2.3.2細菌樣品的分析………………………………………..43
2.4蛋白質資料庫搜尋……………………………………..…...45

參、 結果與討論…………………………………………..….46

3.1已知樣品分析……………………………………………….46
3.2細菌樣品分析……………………………………………….50
3.3再現性的分析………………………………………….……63
3.4資料庫搜尋…………………………………………..………65
3.5直接分析細菌樣品…………………………………………71

肆、 結論………………………………………………………….86

伍、 參考文獻………………………………………………….87


圖目錄

圖1. 質譜儀的組成…………………………………………………….4
圖2. 湯姆生正電流分析儀………………………………….…………5
圖3. 飛行時間式質譜儀……………………………………….………5
圖4. 四極柱質量分析器……………………………………………….6
圖5. 離子阱質譜儀…………………………………………………….7
圖6. 傅立葉轉換質譜儀……………………………………………….8
圖7. 快速原子撞擊游離法裝置……………………………………...10
圖8. 基質輔助雷射去脫附游離法……………………………...……11
圖9. 法拉第杯偵測器…………………………………………….…..13
圖10. 離子噴灑法………………………………………….…………14
圖11. 泰勒錐形成示意圖…………………………………………….16
圖12. 液滴表面溶劑揮發與液滴爆裂過程……………………….…16
圖13. 革蘭氏陽性與陰性菌細胞構造………………………………...23
圖14. 四種樣品的質譜圖: (A) 胰島素 (B) 細胞色素 (C ) 肌血紅素 (D) 碳酸酐脢……………………………………………......…47
圖15. 四種樣品混合……………………………….…………………48
圖16.已知樣品混合物經由LC分離,梯度B 30%��90% 跑15分鐘………………………………………………………………..49
圖17. E. coli溶於去離子水,vortex 5分鐘,gradient B 30% ��90%時間15分鐘…………………….…………………………………..51

圖18. E. coli溶於去離子水,vortex 5分鐘,gradient B 30% ��90%時間30分鐘……………………………………………….……......52
圖19. 圖 (18) 中一個峰存在兩個蛋白質訊號 (a) 22.2分鐘 (b) 22.4分鐘 (E. Coli樣品)………………...…………………………….54
圖20. E. Coli樣品 (a) 為以Acetonitrile/water 40:60為萃取溶劑 (b) 以PBS為萃取溶劑..………………………………....…………62
圖21. E. Coli樣品以去離子水為萃取溶劑vortex 5分鐘,做一系列的複製性實驗的 TIC 圖及所得到的蛋白質數目…..……….64
圖22. B. subtilis 168的質譜圖…………………………………...…….72
圖23. Xanthomonas campesttris Xv 36的圖…………………………..74
圖24. Xanthomonas campestris Xv 36以不同比例萃取溶劑萃取的質譜
圖含0.1% formic acid的 acetonitrile水溶液,acetonitrile所佔比
例為 (a) 50% (b) 70% (c) 80% (d) 90% …...…………………..75
圖25. 不同屬細菌的質譜圖 (a) B. subtilis 168 (b) X .camp. Xv36
(c) Streptococcus bovis (d) Staphylococcus aureus NO.1……..….77
圖26. 同屬不同種的鏈球菌質譜圖 (a) S. bovis (b) S. sangius
(c) S. agalactiae (d) S. pyogenes Sw 117………………….………78
圖27. Streptococcus pyogenes Sw117的質譜圖與CAD譜圖…………79
圖28. Staphylococcus aureus NO.1的質譜圖…………………….....…80
圖29. (a) Streptococcus pyogenes Sw117
(b) Streptococcus pyogenes M29588……………...…………….82
圖30. (a) Staphylococcus aureus NO.1
(b) Staphylococcus aureus NO.2………….………………….…83

圖31. Streptococcus bovis 相同樣品再現性實驗
(a) 第1天 (b) 第20天 (c) 第30天…..………………………84
圖32. Streptococcus bovis 相同樣品不同時間培養
(a) 第1天 (b) 第17天…………….……………………………85




















表目錄

表1.常用的基質輔助雷射去脫附游離法基質……………….………12
表2.各種打破細胞形式的優缺點……………………….……..………25
表3.各菌種培養條件…………………………………….……..………40
表4. E. Coli樣品去離子水vortex 5分鐘的蛋白質訊號………………55
表5.E. Coli樣品相同溶劑 (去離子水) 不同前處理方式……………56
表6. E. Coli樣品相同萃取方式 (vortex) 不同溶劑的比較…………60
表7. E. Coli樣品不同樣品前處理所得到的訊號…………………...61
表8. E. Coli樣品將以PBS為萃取溶劑所得到的數據經過資料庫搜尋後,製成的圖表……….………………..………………….………66
表9. E. Coli樣品以去離子水為萃取溶劑所得到的數據經過資料庫搜尋後,製成的圖………………………………………………….67
表10. E. Coli樣品不同樣品前處理方式在蛋白質資料庫中所對應的微生物與所佔百分比………………………………………………..69
表11. E. Coli樣品質量範圍20 kDa~60 kDa資料庫搜尋結果………70
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