臺灣博碩士論文加值系統

摘要

本研究主要是利用自動化序列注入系統進行線上微波水解並連接免疫親和質譜法分析尿液中之嗎啡，來取代傳統酵素或酸水解的前處理方式。此系統之設計分為兩方面，包含有封閉式與開放式之微波水解系統，且均具有自動化與節省時間之優點。另外透過此單株抗體對M3G也具親和性之特性，發展多重分析(multiresidues analysis)，其分析之對象為嗎啡與其代謝物Morphine-3-glucuronide（M3G）與Morphine-6-glucurronide（M6G）。
封閉式之微波水解系統在微波加熱時間6秒及650W之微波功率下，M3G之水解率可達92%，嗎啡之線性範圍為100至4000 ppb。在開放式之微波水解系統方面，則是在微波時間80秒及230W之微波功率下，M3G之水解率可達到95%，其嗎啡之線性範圍為200至4000ppb。至於偵測陽性煙毒犯之尿液與法定之慈濟檢測中心GC-MS之結果相比對均具有一致性。
同步分析嗎啡、M3G與M6G方面，由於可省略微波水解之步驟，因此可將總分析時間縮短為12分鐘內，嗎啡之線性範圍為50至2000ppb，M3G與M6G則為300至2000ppb。嗎啡與M3G如使用Morphine-D6與M3G-D3為內標準品，不會造成互相干擾，亦不受到6-acetylmorphine與codeine之影響，因此可成功的同步分析Morphine、M3G與M6G。至於偵測陽性煙毒犯之尿液與法定之慈濟檢測中心GC-MS之結果相比對具有一致性。

Abstract

An on–line microwave hydrolysis and immunoaffinity electrospray mass spectrometry using sequential injection analysis（SIA）was developed for the analysis of morphine and morphine-glucuronides in urine. The urine samples pretreated by off-line enzyme or acid hydrolysis to produce the morphine from its glucuronide derivates were here replaced by microwave assistant hydrolysis using SIA. The hydrolysis efficiency of morphine-3-glucuronide（M3G）in closed and opened microwave hydrolysis system is 92% for 6s and 95% for 80s respectively. The detection limit of morphine in urine was 100ppb（6s）and 200ppb（80s）. The linearity from 100 to 4000ppb and 200 to 4000ppb were observed, respectively. The morphine-6-glucuronide can be efficiently hydrolyzed using this method. Furthermore, a system to analysis morphine and its glucuronides simultaneously was developed. The aimed was to determine morphine and its glucuronides derivates by immunoaffinity in SIA and analyzed by mass spectrometry. Thus, the hydrolysis pretreatment can be omitted. The detection limits are 50ppb for morphine and 300ppb for M3G and M6G, respectively. Linearity was observed in the concentration range 50 to 2000ppb（morphine）and 300 to 2000ppb（M3G and M6G）The higher throughput and automation can be achieved by these systems. The real urine samples from abused patients were studied and compared with the GC-MS method.

目錄
第一章 緒論 1
一、嗎啡的介紹 1
（一）嗎啡偵測的重要性 1
（二）嗎啡的前處理 1
（三）嗎啡的偵測方法 1
二、以水解法處理生物樣品 3
（一） 尿中嗎啡尿苷酸化合物之酸水解與酵素水解之比較 3
（二）尿中其他藥物複合物的水解 3
（三）非傳統藥毒物分析之檢測樣品水解 4
三、微波水解 5
（一）微波加熱的原理與應用 5
（二）批次（batch）微波加熱系統 6
（三）Flow injection analysis（FIA）微波加熱系統 6
（四）Sequential injection analysis（SIA）微波加熱系統 7
四、免疫固相萃取 8
（一）抗體的簡介 8
（二）免疫固相萃取的簡介 8
（三）免疫固相萃取的應用 9
五、電灑質譜術 10
（一）電灑離子化原理 10
（二）電灑離子形成機制 10
第二章、材料與方法 11
一、實驗用藥品 11
二、實驗儀器與器材 12
三、實驗步驟 13
（一）抗體固定化方法 13
（二）系統控制time program 14
1、封閉式微波水解SIA-MS系統控制time program 14
2、開放式微波水解SIA-MS系統控制time program 15
3、同步分析嗎啡、M3G與M6G之ESI-MS系統 16
第三章、結果與討論 17
一、電灑質譜法之條件選擇 17
二、SIA系統條件之選擇 18
（一）封閉式微波水解系統 18
（二）開放式微波水解系統 19
（三）同步分析嗎啡、M3G與M6G之ESI-MS系統 20
三、抗體之選擇性的測試 21
（一）抗體（8.31mg/g CPG）對嗎啡之捕捉能力測試 21
（二）抗體（16.4mg/g CPG）對嗎啡與M3G之捕捉能力 21
四、嗎啡、M3G與M6G之檢量線 21
（一）封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線 21
（二）開放式微波水解系統之嗎啡檢量線 22
（三）同步分析嗎啡、M3G與M6G之檢量線 22
五、同步分析Morphine與M3G之回收率 23
六、6-Acetylmorphine與codeine對分析嗎啡與M3G的干擾 23
七、真實尿液樣品分析 23八、線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS比較 24
第四章、結論與展望 25
第五章、參考文獻 26

表目錄
表1-1 嗎啡尿苷酸化合物之酸性水解與酵素水解之比較 30
表1-2 微波前處理在FIA與SIA的應用 31
表2-1 SIA-Hydrolysis(封閉式)-ESI-MS系統控制time program
32
表2-2 SIA-Hydrolysis(開放式)-ESI-MS系統控制time program
33
表2-3 同步分析嗎啡、M3G與M6G之系統控制time program 34
表3-1 嗎啡與Glucuronides之電灑質譜法條件選擇 35
表3-2 封閉式微波水解系統之嗎啡檢量線 36
表3-3 同步分析morphine、M3G與M6G在ESI-MS與SIA-ESI-
MS之檢量線比較 36
表3-4 同步分析Morphine與M3G之recovery 37
表3-5 6-Acetylmorphine對Morphine與M3G定量的影響 37
表3-6 codeine對Morphine與M3G定量的影響 37
表3-7 封閉式微波水解系統之真實尿液樣品分析 38
表3-8 開放式微波水解系統之真實尿液樣品分析 38
表3-9 同步分析Morphine、M3G與M6G之真實尿液樣品 39
表3-10 線上封閉式與開放式微波水解系統與非線上GC-MS
的比較 40

圖目錄
圖1-1 鴉片類藥物代謝圖 41
圖1-2 序列注入系統結構圖 42
圖1-3 免疫球蛋白（IgG）簡化的分子結構圖 43
圖1-4 生物辨識元的固定方法 44
圖1-5 免疫親和樣品分離流程圖 45
圖1-6 ESI-MS儀器裝置圖 46
圖2-1 SIA-Hydrolysis-ESI（封閉式）裝置圖 47
圖2-2 SIA-Hydrolysis-ESI（開放式）裝置圖 48
圖 2-3 SIA-ESI儀器構造圖 49
圖3-1 溶於 formic acid pH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖 50
圖3-2 溶於 formic acid pH2.1中之1ppm嗎啡質譜圖 51
圖3-3 溶於 formic acid pH2.1中之1ppm M3G質譜圖 52
圖3-4 溶於 formic acid pH2.1中之1ppm M6G質譜圖 53
圖3-5 封閉式微波水解統之微波功率對M3G水解率的影響 54
圖3-6 封閉式微波水解系統對溶於水中M3G水解率的測定 55
圖3-7 開放式微波水解系統之微波時間對M3G水解率的影響 56
圖3-8 開放式微波水解系統對M3G之水解率穩定度的測定 57
圖3-9 抗體(8.31 mg/g CPG)對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試 58
圖3-10 抗體(16.4 mg/g CPG)對溶於水中嗎啡之捕捉能力測試 59
圖3-11 抗體 (16.4 mg/g CPG)對溶於水中M3G之捕捉能力 60
圖3-12 開放式微波水解系統對溶於尿液中嗎啡之檢量線 61

第五章、參考文獻
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