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研究生:丁慶成
論文名稱:應用AFLP於香魚片中有毒河魨之檢測
論文名稱(外文):Detection of toxic puffer fish species in dried seasoned puffer fish by amplify fragment length polymorphism(AFLP) analysis
指導教授:許祥純許祥純引用關係廖遠東
學位類別:碩士
校院名稱:國立屏東科技大學
系所名稱:食品科學系
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:86
中文關鍵詞:河魨擴大片段長度多型性隨機增幅多型性
外文關鍵詞:puffer fishAFLPRAPD
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中文摘要
M8836013
論文名稱:應用AFLP於香魚片中有毒河魨之檢測 頁數:86
校所組別:國立屏東科技大學食品科學系研究所碩士班
畢業時間及摘要別:九十學年度第二學期碩士學位論文摘要
研究生:丁慶成 指導教授: 許祥純、廖遠東博士
論文摘要內容:
河魨為具有神經毒素之魚類,誤食其毒素會造成中毒及死亡,目前河魨之檢測方法僅能以生物檢測法測定毒性,但無法判別出是何種有毒之河魨,因此本研究針對河魨進行品種鑑別,萃取13種河魨及河魨香魚片之DNA,加入限制酶進行切割反應,再以PCR增幅限制片段,利用擴大片段長度多型性(AFLP)分析,建立有效的AFLP指紋圖譜及其實驗條件,用以快速鑑別有毒及無毒品種。結果發現限制酶切割及轉接子連接分別為37℃, 2小時及20℃隔夜反應較為適當,而預擴大反應條件則為94℃ 30 秒、56℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘共20循環。擴大反應則以touch down 的方式設定annealing 溫度每循環降0.7℃(65→56℃)共12循環,之後再進行23循環的擴大反應,條件為94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 1分鐘共23循環。使用的九種引子組合,以A2、B1、B2、B3、C1的檢測效果最佳,可檢測出河魨品種間的差異性,且可發現在同屬中有毒與無毒河魨具有多型性片段,進而辨別河魨品種。
本研究亦使用20組Operon kit primer 做RAPD增幅,發現最適DNA濃度為200ng ,增幅條件94℃ 2分鐘、94℃ 1分鐘、37℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘,連續30個循環再以94℃ 1分鐘、37℃ 2分鐘、72℃ 12分鐘進行PCR反應,結果OPAA.6、OPAA.9、OPAA.10、OPAA.14、OPZ.5、OPZ.6、OPY.4、OPY.6、OPY.7等九組引子具有較佳增幅結果,也可以應用於河魨種源鑑別之參考。
目錄
頁次
中文摘要…………………………………………………….……. I
英文摘要………………………………...……………..…………III
誌謝………………………………………….…………………….V
目錄………………………………...……………………………..VI
圖索引…………………………………………………………….IX
表索引…………………………………....………………………Xll
第一章 前言…………………...…………………………………1
第二章 文獻回顧………….……………..………………………4
2.1食用河魨之歷史………………………...……………………..4
2.2河魨分類…………………………………...…………………..5
2.2.1魨形目(Tetrodontiformes)……………..…………………..6
2.2.2鱗魨亞目(Balistidei)…………………...………………….6
2.2.3箱魨亞目(Ostracioidei)………….……..………………….6
2.2.4魨亞目(Tetrodontoidei)………….…….….……………….6
2.3河魨魚獲狀況…………….………….…….…………………..7
2.4河魨之加工利用與管理…….……….…….…………………..9
2.5河魨毒(tetrodotoxin, TTX)……………….…………………..13
2.5.1中毒作用機轉…………….……………………………...13
2.5.2河魨毒之鑑定……………………………………………19
2.5.2.1薄層分析…………………………………………….19
2.5.2.2電泳分析…………………………………………….19
2.5.2.3高效能液相層析…………………………………….19
2.6蛋白質分析………………………………………….………..20
2.7 DNA比對…………………………………….……….………21
2.7.1 PCR技術………………………………….…….………..22
2.7.2限制酵素片段長度多型性………….……….…………..22
2.7.3 RAPD-PCR……………………………..………………..25
2.7.4 AFLP…………………………………………..…………26
2.7.4.1轉接子之黏接(ligation of adapters)…….……..…….26
2.7.4.2 PCR增幅(PCR amplification)………….…………...27
2.8分析方法………………………………………….……….….27
2.9 AFLP應用………………………………………..………..….28
第三章 材料與方法………………………………..…………...31
3.1實驗架構………………………………………..…………….31
3.2樣品來源………………………………………..…………….32
3.3.1生肉………………………………………..……………..32
3.3.2香魚片製備………………………..……………………..32
3.4 DNA萃取……………………………..………………………34
3.4.1.儀器……………………………………..………………..34
3.4.2.試劑……………………………………..………………..34
3.4.3. DNA萃取…………………………….…………….……35
3.4.4. DNA濃度及品質鑑定………………….……….………35
3.5 AFLP分析…………………………….……..……….……….36
3.5.1 DNA之限制酵素切割反應………………..…….………36
3.5.2轉接子接合……………………………...……………….36
3.5.3預擴大反應………………………...…………………….37
3.5.4選擇性擴大多型性片段反應…………….…...…………37
3.5.5電泳…………………………………...………………….38
3.5.6銀染……………………...…………………………….39
3.6 RAPD-PCR…………………...…………..………………..…39
3.6.1 PCR反應液…………………..……..…………………...40
3.6.2 PCR增幅條件……………………..…….……………....40
3.6.3 PCR增幅產物分析……………..……………………….40
3.7圖譜分析………………………………….….……………….40
第四章 結果與討論………………………….……….………...42
4.1 AFLP…………………………………………..……………...42
4.1.1 AFLP操作條件之建立……………….……….………...42
4.1.1.1限制酵素切割及轉接子接合之條件建立……….…42
4.1.1.2選擇性預擴大反應條件之建立………………...…..43
4.1.1.3選擇性擴大反應條件之建立…………………...…..43
4.1.2 AFLP圖譜分析…………………………………………..44
4.2 RAPD…………………………………………………………55
4.2.1不同河魨DNA濃度對RAPD產物之影響………….…55
4.2.2新鮮河魨及加工香魚片不同之RAPD增幅片段………55
4.2.3不同引子組RAPD增幅片段之比較…………..……..…57
第五章 總結………………………………………………...…..67
第六章 參考文獻……………………………...………………..72
作者簡介……………………………………………………...…..86
第六章.參考文獻
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