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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:柯智升
論文名稱:固定化細胞應用於光學分割反應之研究
指導教授:朱一民朱一民引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:化學工程學系
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
中文關鍵詞:光學分割光學純度
外文關鍵詞:genipinMAMP
相關次數:
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近年來由於各國政府不斷地強調生物技術在未來產業應用之重要性,以及投資了龐大經費於基礎與應用研究,因此生物技術相關產業無疑的將是係屬於世界各國熱烈競相發展的二十一世明星產業。生物觸媒(細胞、酵素或部分細胞)也受到相當的重視,其應用於食品製造、環境工程、藥物、清潔劑上均有商業化的商品,產值逐年增加。以固定化技術實施於生物觸媒,可使生物觸媒之再利用率提升,有效降低成本等好處。
  以全細胞作為固定化之對象,不但可節省酵素純化之工作,同時可提供一些反應所須的輔脢。
  本研究利用全細胞─Pseudomonas fluorescens對S,R-MAMP(R,S
-Methyl-3-Acetylthio-2-Methylpropionat)進行光學分割反應,以轉化產生S-AMPA(S-Acethylthio-2-Methylpropionic Acid)。實驗發現
S,R-MAMP不但會自然水解生成S,R-AMPA,而且S,R-AMPA的
thioester-bonding亦會自然水解生成β-mercaptoisobutyric acid。在
Pseudomonas fluorescens酵素水解的特性上,就熱穩定性和pH值穩定性方面,實驗數據上顯示,在靜置溫度高於50℃時,細菌體內酵素急速失活。至於靜置在pH值7-8之間時,細菌體內酵素有較好的穩定性。
  於反應中加入碳源,對細菌體內酵素活性並沒有明顯的提升,但添加Sn2+對細菌體內酵素稍微有提升的效果,培養基探討方面,其最適培養基:soybean meal:5g/l,yeast extract:5g/l,lactose:5g/l,NaCl:5g/l,菜籽油:4g/l。最適反應溫度為30℃,最適反應pH=10,最適菌體包覆量為0.6g菌/50ml alginate gel。
  實驗結果顯示以genipin為交聯劑,經交聯後的固定化擔體活性明顯下降,濃度超過11.2mM後菌體內酵素失活愈嚴重。經固定化之菌體動力學常數與未固定化菌體之動力學常數截然不同,分別為Vm=7697(U/g-cell),Km=0.2(M)與Vm=10000(U/g-cell),Km=0.1(M),這表示固定化後酵素與基質的親和性變差了,且有質傳阻力效應存在。以平均粒徑為1mm之固定化圓珠具較佳活性。最適條件進行25個批次反應,歷時10天,其固定化菌體仍保有80%以上的相對活性,即表示有良好的重複使用性。
  在30℃,pH=10,170rpm與添加0.1M SnCl2的條件下以固定化全細胞進行MAMP光學分割可得產率55%,光學純度(e.e值)為90%的S-AMPA。本研究目的,利用全細胞固定於擔體上,以製備高純度、高產率的S-AMPA。
摘要 I
目錄 Ⅲ
表圖目錄 Ⅷ
第一章 研究範圍與目的 1
第二章 文獻回顧 4
2.1固定化細胞演進 4
2.2固定化優缺點 4
2-3固定化細胞的選擇 5
2-4細胞的固定化方法 6
2-5固定化生物細胞之特性 8
2-6抗心臟衰竭藥物 10
2-7酵素催化不對稱反應之應用 11
2-8離子鍵結網路包覆 12
2-9天然交聯劑Genipin之簡介 17
第三章 實驗材料與方法 26
3-1 MAMP之製備及純化 26
3-1-1醯氯化反應與diastereomers之製備 26
3-2菌體培養 27
3-3基質及產物之分析方法 27
3-3-1水解活性定義 27
3-4 Pseudomonas fluorescens IFO-12055酵素的特性 28
3-4-1熱穩定性(Thermostability) 28
3-4-2 pH值穩定性 28
3-4-3最適反應pH與溫度 28
3-4-4 S-AMPA濃度對活性的影響 28
3-4-5添加不同碳源對MAMP水解反應之影響 28
3-4-6添加不同金屬離子對MAMP水解反應之影響 28
3-5 AMPA純化 29
3-6探討Pseudomonas fluorescens IFO 12055提高lipase活性 29
所需的營養需求
3-6-1不同碳源對lipase生產之影響 29
3-6-2不同氮源對lipase生產之影響 30
3-6-3最適之碳源、氮源添加量對菌體生長與lipase活性之影
響 30
3-7固定化菌體之程序 30
3-7-1以Chitosan為固定化材質 30
3-7-2以Chitosan-alginate為固定化材質 30
3-7-3以Alginate-PEI為固定化材質 31
3-8固定化菌體特性探討 31
3-8-1 最適反應溫度與pH 31
3-8-2菌體包埋量對水解反應活性之影響 32
3-8-3動力學常數Vm與Km 32
3-8-4交聯劑Genipin濃度對菌體活性之影響 32
3-9不同顆粒大小的固定化圓珠對反應活性之影響 33
3-10固定化菌體批次反應之操作穩定性 33
第四章 實驗材料與設備 37
4-1分析儀器 37
4-2 其他設備 37
4-3 藥品與材料 39
第五章 結果與討論 41
5-1濃度及光學純度測定方法之建立 41
5-2自然水解反應之探討 41
5-3菌體的培養 42
5-3-1探討Pseudomonas fluorescens IFO 12055再提高 42
lipase活性所需的營養需求
5-4Pseudomonas fluorescens IFO 12055水解反應之特性 44
5-4-1熱穩定性與pH值穩定性 44
5-4-2最適反應pH 45
5-4-3最適反應溫度 45
5-4-4添加不同碳源對MAMP水解反應之影響 46
5-4-5添加不同離子對MAMP水解反應之影響 46
5-4-6 S-AMPA濃度對活性的影響 46
5-5固定化擔體的篩選與製備 47
5-6固定化菌體特性探討 48
5-6-1 pH值對固定化菌體活性的影響 48
5-6-2溫度對於菌體內酵素活性之影響 48
5-6-3菌體包埋量對水解反應活性之影響 49
5-6-4動力學常數Km與Vm之測定 49
5-6-5交聯劑Genipin濃度對固定化菌體活性之影響 50
5-6-6不同顆粒大小的固定化圓珠對水解反應活性之影響 50
5-5-7固定化菌體批次反應之操作穩定性 51
第六章 結論 80
第七章 參考文獻 82
附錄一 86

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