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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:郝旭昶
論文名稱:基因晶片系統基因純化及應用於CMV病毒感染之研究
論文名稱(外文):Optimization of DNA purification protocols for microarray system and its application on CMV virus infection study
指導教授:許宗雄許宗雄引用關係
指導教授(外文):Tzong-Hsiung Hseu
學位類別:碩士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:生命科學系
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
中文關鍵詞:基因晶片巨細胞病毒MRC-5細胞基因表現
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中文摘要
基因微陣列晶片系統,自1995年由Patrick O.Brown實驗室(Stanford University)成功研發出後,即掀起一股生物、醫學研究之新潮流。該系統為一套觀察大量基因表現之工具,在研究細胞生理及臨床診斷上,是一個相當有力的技術。然而經過六年的探索,基因微陣列晶片系統中,仍有許多影響實驗的變因,有待深入的研究,進一步達到系統之優化。
本論文主要架構可分成三部份:一為cDNA 微陣列系統與巨細胞病毒(cytomegalo virus﹐CMV)的簡介。二為基因微陣列系統之優化相關研究,包括探針DNA純化方式測試、玻片種類。實驗目的是找出基因微陣列實驗的重要參數,以便後續研究者參考遵循。三為利用基因微陣列系統,觀察巨細胞病毒感染後,宿主(MRC-5 Cell)基因表現差異的影響。將受感染MRC-5細胞於感染後,8、24、72小時三個時間點中,分別取出實驗組及對照組MRC-5細胞的Total RNA,進行基因微陣列實驗。
本論文之目的為:(一)找出一種快速、方便、便宜且不影響實驗結果的純化方式與載具玻片。(二)觀察MRC-5細胞受CMV感染後8、24、72小時,宿主細胞(MRC-5)及病毒(CMV)的基因表現,所受到的影響。根據這兩種生物系統的基因表現變化情形,進而探討病毒與寄主之間,基因表現的相互作用。
關鍵字:基因微陣列實驗,巨細胞病毒(CMV),MRC-5細胞,基因表現。

目錄
中文摘要………………………………………………………… I
英文摘要…………………………………………………………… II
致謝 …………………………………………………………III
目錄 ………………………………………………………IV
圖目錄與表目錄……………………………………………………VI
第一章 緒論……………………………………………………………1
1-1 前言 …………………………………………………………… 1
1-2 研究動機及目標…………………………………………………2
第二章 CMV病毒簡介……………………………………………………3
第三章 基因晶片介紹………………………………………………12
3-1 微陣列系統類型……………………………………………12
3-1.1 寡聚核甘酸基因晶片生物晶片系統……………………12
3-1.2 互補DNA微陣列 …………………………………………14
3-2 cDNA 微陣列基因晶片實驗流程…………………………15
3-2.1 探針基因點印…………………………………………… 15
3-2.2. 雜合反應…………………………………………………17
3-2.3 玻片掃描………………………………………………… 17
3-2.4 影像分析………………………………………………… 17
3-3 幾種基因晶片比較…………………………………………… 19
第四章 cDNA微陣列生醫應用理論與限制………………………21
第五章 實驗設計與流程………………………………………………27
5-1 微陣列基因晶片系統最佳化測試的實驗流程……………27
5-1.1 探針備製與打印…………………………………………29
5-1.2 限制非特異性鍵結………………………………………31
5-1.3 雜合反應…………………………………………………31
5-1.4 掃瞄條件…………………………………………………31
5-2 巨細胞病毒(CMV)感染生物效應的實驗流程…………………31
5-2.1 細胞培養…………………………………………………32
5-2.2 病毒備製…………………………………………………32
5-2.3 測量 CMV 價效……………………………………………32
5-2.4 CMV生物效應晶片製作……………………………………32
5-2.5訂出實驗系統誤差與判別基因表現差異量………………34
5-2.6 巨細胞病毒(CMV)感染生物效應…………………………34
第六章 實驗結果討論…………………………………………………35
6-1 探針純化的方式……………………………………………… 35
6-1.1 不同探針純化方式的回收率……………………………35
6-1.2 不同探針純化方式的純度……………………………… 39
6-2 各廠牌的玻片基本特性……………………………………… 42
6-3 時間對玻片的影響 ……………………………………………45
6-4 探針純化方式與玻片的相互關係對實驗的影響…………… 45
6-4.1 探針純化方式與玻片經打印程序時的交互影響……… 45
6-4.2 探針純化方式與玻片經雜合反應時的交互影響……… 52
6-5 “ MRC-5 ” 細胞株的生長曲線 ………………………………58
6-6 “ MRC-5 ” 的Total RNA 備製……………………………… 58
6-7 訂出本實驗系統的系統誤差………………………………… 59
6-7.1歸一化方法…………………………………………………62
6-7.2 歸一化方法的比較…………………………………………64
6-7.3 不同針之間的差異…………………………………………66
6-7.4 背景值的影響…………………………………………………
6-8 巨細胞病毒(CMV)感染生物效應初探…………………………69
6-8.1 MRC-5細胞感染巨細胞病毒(CMV)後細胞壞死現象………
6-8.2使用Microarray觀察巨細胞病毒(CMV)感染所引起的生物效應…………………………………………………………
參考文獻……………………………………………………………
附錄 A:酒精純化程序……………………………………………………
附錄 B:食品工業發展研究所……………………………………………
附錄 C:歸一化程式………………………………………………………
附錄 D:各玻片使用說明…………………………………………………
圖表目錄
圖 2-1 疱疹病毒群的DNA構造……………………………………… 8
圖 3-1 oligonucleotides微陣列流程簡圖…………………………12
圖 3-2 oligonucleotides微陣列流程圖(1)………………………13
圖 3-3 oligonucleotides微陣列流程圖(2)………………………14
圖 3-4 cDNA微陣列流程簡圖…………………………………………15
圖 3-5 Array簡圖…………………………………………………… 16
圖 3-6 Array實物圖………………………………………………… 16
圖 4-1生物體基因表現過程簡圖………………………………………
圖 5-1 打印玻片順序…………………………………………………30
圖 5-2 探針在玻片上分佈的情形……………………………………30
圖 5-3 HEL 299 正常形態……………………………………………30
圖 5-4 HEL 299 正常形態(24hr)……………………………………30
圖 5-5 HEL 299 感染後形態(24hr)…………………………………30
圖 5-6 HEL 299 正常形態(48hr)……………………………………30
圖 5-7 HEL 299 感染後形態(48hr)…………………………………30
圖 5-8 區塊內基因排列情形…………………………………………33
圖 5-9 區塊在玻片上排列的情形內基因排列情形…………………33
圖 6-1電泳影像測量法(1 % agarose gel)電泳圖…………………36
圖 6-2電泳與OD 純度比較圖……………………………………… 41
圖 6-3各廠牌玻片掃瞄圖………………………………………………
圖 6-4各廠牌玻片空片強度分析圖………………………………… 43
圖 6-5不同時間玻片表面強度分析圖……………………………… 44
圖 6-6 Corning掃瞄圖……………………………………………
圖 6-7 ArrayIt掃瞄圖…………………………………………………
圖 6-8 Mbpl-2掃瞄圖…………………………………………………
圖 6-9 Mbpl-1掃瞄圖……………………………………………………
圖 6-10良率評分說明圖…………………………………………………
圖 6-11確定螢光物質標定圖…………………………………………
圖 6-12 PCR反應產物圖…………………………………………………
圖 6-13雜合反應濃度測試圖…………………………………………
圖 6-14各玻片Cy3螢光強度…………………………………………
圖 6-15各玻片背景螢光強度……………………………………………
圖 6-16各玻片SNR值…………………………………………………
圖 6-17 MRC-5長曲線圖…………………………………………………
圖 6-18 MRC-5 total RNA 電泳圖………………………………………圖 6-19 CMV生物效應晶片雜合反應後的影像(部分) ………………
圖 6-20 Cy3、Cy5 激發/放射光譜…………………………………
圖 6-21整體歸一化表示圖……………………………………………
圖 6-22整體歸一化使用MA-plot 說明圖……………………………
圖 6-23相依強度歸一化表示圖…………………………………………
圖 6-24個別針整體歸一化(Cy5、 Cy3)散佈圖………………………
圖 6-25個別針相依強度歸一化 MA圖………………………………
圖 6-26每一根針作歸一化 MA圖……………………………………
圖6-27 Background Subtraction(左)與No Background Subtraction(右) MA圖……………………………………
圖 6-28 A:MRC-5細胞未感染CMV前的形態……………………………
圖 6-28 B:MRC-5細胞未感染CMV,培養72小時的形態………………
圖 6-28 C、D:MRC-5細胞感染CMV,培養72小時的形態………………
圖 6-28 E、F:MRC-5細胞感染CMV,培養6天的形態……………………
圖 6-29 A巨細胞病毒(CMV)感染後8小時的Microarray影像:32個區塊全圖……………………………………………………
圖 6-29 B、C巨細胞病毒(CMV)感染後8小時的Microarray影像:特定區塊放大圖………………………………………………
圖6-30 A:巨細胞病毒(CMV)感染後24小時的Microarray影像………
圖6-30 B:巨細胞病毒(CMV)感染後72小時的Microarray影像………
圖6-31 MRC-5感染CMV 8小時,微陣列實驗M-A Plot…………………
表 3-1螢光強度偵測表…………………………………………………
表 3-2幾種基因晶片比較………………………………………………
表 6-1電泳影像測量法(1 % agarose gel)測量值………………36
表 6-2光密度比較法(O.D 測量法)測量值…………………………36
表 6-3電泳影像測量法測量值(除以PCR 100%)……………………37
表 6-4光密度比較法測量值(除以PCR 100%)………………………37
表 6-5實驗誤差比較表……………………………………………… 37
表 6-6 ANOVA分析表(回收率) ………………………………………39
表 6-7電泳與OD 純度比較表……………………………………… 41
表 6-8各廠牌玻片售價成本表……………………………………… 42
表 6-9各廠牌玻片良率評分表…………………………………………
表 6-10各純化方式良率評分表…………………………………………
表 6-11各玻片SNR比較表……………………………………………
表 6-12 ArrayIt、Mbpl-2、Corning ANOVA分析表(SNR) …………
表 6-13 Mbpl-2、Corning ANOVA分析表(SNR)………………………
表 6-14雜合反應後良率比較表…………………………………………

參考文獻
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