臺灣博碩士論文加值系統

高效液相層析（HPLC）及毛細管電泳（CE）是目前最常用來測定中藥成分含量的分析方法。綜合兩者的優點，合併運用，可以拓展中藥化學評價的範疇。
本研究分三個部分，第一部分為生體介質中黃連成分之測量，我們採用分析黃連的CE方法，在22分鐘內完成三黃瀉心湯中的epiberberine、columbamine、berberastine、jatrorrhizine、berberine、palmatine、coptisine和magnoflorine等8個黃連生物鹼含量的測定，以探討三黃瀉心湯製劑在人工胃液、腸液中各成分含量的變化。結果發現黃連成分統計趨勢圖在人工胃液中幾不變動，但人工腸液的水層萃出物則和三黃瀉心湯組成藥材配伍之改變有關，當配伍中的大黃/黃芩比例增加時，黃連成分含量有下降趨勢，該現象可能來自溶解度及錯合沈澱物生成。另外，檢測餵食不同萃取方式的三黃浸膏之老鼠血清及尿液，發現在餵食24小時後的尿液才能用CE偵測得到，血清則偵測不到。
第二部分為開發HPLC分析方法，以偵測小白鼠尿液、血清中之稀薄黃連成分。本研究採梯度沖提的HPLC系統，流動相（A）為10mM KH2PO4 酸性水溶液（以10％H3PO4調整pH至2.63），（B）為CH3CN/H2O = 70/30（V/V）；小白鼠尿液、血清用氰甲烷萃取、濃縮，於80分鐘內可完成epiberberine、coptisine、berberine和palmatine等四個黃連生物鹼成分的分析。至於columbamine、jatrorrhizine 、berberastine和magnoflorine之吸收峰則與黃芩成分重疊，無法定量。本文比較三黃藥材個別煎煮、50％乙醇萃取和三黃藥材混和煎煮之三種浸膏樣品在動物體內的吸收代謝差異，結果發現不論餵食那一種浸膏，其尿液皆在12小時後，才呈現明顯黃連成分吸收峰；其中餵食混煎三黃浸膏之老鼠的尿中濃度含量最高。另外從各成份偵測值趨勢變化圖可發現餵食不同三黃浸膏之老鼠，各成份在血清中存留時間都很長。
第三部分為開發薑黃藥材之HPLC分析方法，薑黃為薑科植物薑黃 Curcuma longa Linn.的乾燥根莖，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等作用。本研究採梯度沖提系統，流動相（A）10mM KH2PO4 酸性水溶液（以1％H3PO4調整pH至3.30），（B）CH3CN/H2O = 80/20（V/V），在分離管柱Cosmosile 5C18-MS、偵測波長254及280 nm的條件下，於40分鐘內完成分析薑黃藥材的α-turmerone、β-turmerone、ar-turmerone、 curcumin、demethoxycurcumin、bisdemethoxycurcumin、curcumenol和germacrone-13-al等八個指標成分。實驗結果顯示，本LC方法再現性良好，同一天與不同天滯留時間相對標準偏差分別在0.53-1.12%與0.02-0.69%之間，各成分回收率在96.8-104.2%之間。本研究另開發LC-MS分析方法，使用流動相(A)0.025% trifluoroacetic acid (TFA)，(B)MeOH/CH3CN/0.025%TFA = 50/30/20（V/V），可以分離α-turmerone與β-turmerone，用LC-MS的ESI+離子的模式可以確認各波峰成分。

Abstract
High-performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE) are currently the most commonly used analysis methods for determining the contents of constituents in Chinese herb drugs. By combining the superiorities of both methods, we can expand the scope of chemical appraisal of Chinese herb drugs.
This study is divided into three parts. The first part deals with the determination of Coptidis Rhizoma’s constituents in a living body. We adopted the CE method that has been used for the analysis of Coptidis Rhizoma. Within 22 minutes, we finished the determination of the eight alkaloids of Coptidis Rhizoma, namely epiberberine, columbamine, berberastine, jatrorrhizine, berberine, palmatine, coptisine and magnoflorine. Thereby we investigate the variation with the various constituents of the herb formula Coptis and Rhubarb Combination in artificial gastric fluid and artificial intestinal fluid. As a result, we found the contents of constituents did not change in artificial gastric fluid, but in the aqueous layer extracted from the artificial intestinal fluid, they changed someway related to the change in the composition of the formula. For example, as the rhubarb/scute ratio of the formula increases, the contents of the constituents of Coptidis Rhizoma displayed a decline tendency. Such a phenomenon could be attributable to solubility and formation of complexed precipitates . Besides, as mice were fed with the extracts of the formula extracted by different methods and the mice’s urine and serum were detected, it was found that only 24 hours after feeding can alkaloid constituents in the urine samples be detectable by CE, while serum samples were undetectable.
The second part is about the development of HPLC methods for detecting the trace amount contents of Coptidis Rhizoma constituents in the mouse’s urine and serum. The study applied the gradient elution system of HPLC with the mobile phases (A) composed of 10 mM KH2PO4 in an acid solution (adjusted to pH 2.63 with 10% H3PO4) and (B) composed of CH3CN/H2O = 70/30 (v/v). The mouse’s urine and serum was extracted with acetonitrile, concentrated and analyzed within 80 min for the four alkaloids of Coptidis Rhizoma: epiberberine, coptisine, berberine and palmatine. As for the constituents columbamine, jatrorrhizine, berberastine and magnoflorine, their absorption peaks overlapped with those of the constituents of Scutellariae Radix, and were undetectable. This study made a comparison of different extracts of the formula extracted with the ingredients of the formula decocted individually, with 50% ethanol and with the ingredients decocted together, which were fed to mice and their absorption and metabolism within the mice were compared. As a result, it was found that regardless of whichever extract, the peaks of the Coptidis Rhizoma constituents in the urine appeared conspicuously 12 hours later. Among the three extract, that extracted with the ingredients decocted together had the highest contents found in the urine. Also from the chart that showed the tendency of change of the various constituents detected, we found that the constituents of the three extracts all lingered in the serum for a very long time.
The third part of study covers HPLC analyses for Curcuma Tuber. Curcuma Tuber is the dried tuber of the Zingiberaceous plant Curcuma longa Linn, which possesses antiphlogistic, antimicrobial, antioxidation, anticancer and hypoglycemic effects. This study proposed a gradient elution system, with mobile phase (A) comprising 10 mM KH2PO4 in an acid solution (adjusted to pH 3.30 with 1% H3PO4) and (B) CH3CN/H2O = 80/20 (v/v). Using a separating column of Cosmosile 5C18-MS, under detecting wavelengths 254 and 280 nm, and within 40 min, we accomplished analysis of the eight marker substances for Curcuma Tuber, which were α-turmerone, β-turmerone, γ-turmerone, curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin, curcumenol and germacrone-13-al. The experimental results show that LC has very good reproducibility. Retentions times on the intraday day and on interday days differ by only 0.53 —1.12% and 0.02 — 0.69% respectively. The recovery rates of the various constituents are within 96.8 — 104.2%. This study also has developed an LC-MS analysis method using the mobile phase (A) 0.025% trifluoroacetic acid (TFA) and (B) MeOH/CH3CN/0.025%TFA = 50/30/20 (v/v), which can separate α-turmerone and β-turmerone. The peaks have been identified with the ESI+ ionization mode of LC-MS.

圖目錄…………………………………………………………II
表目錄……………………………………………………...…VI
中文摘要……………………………………………………...IX
英文摘要………………………………………………...……XI
第一章 緒論
第一節 前言……………………………………………………………1
第二節 高效能液相層析………………………………………………2
第三節 毛細管電泳分析……..………………………………………..4
第四節 液相層析/電灑/質譜儀…..…………………………………..16
第五節 分析條件參數及適宜性之評估……………………………..19
第二章 黃連藥材之生體轉化研究
第一節 大黃之毛細管電泳分析……………………………………..23
第二節 胃液腸液中黃連成分之定量研究…………………………..33
第三章 生體介質中黃連之成分定量
第一節 黃連成分之高效能液相層析…………………………..……60
第二節 尿液血清中黃連成分之定量研究…………………………..77
第四章 薑黃成分之分析
第一節 薑黃藥成分之高效液相層析………………………………..94
第二節 薑黃成分之LC/MS定性分析……………………………...126
第五章 結論……………………………………………………..……..148
參考文獻………………………………………………………………153
附錄一 薑黃分析成分UV圖……………………………………160
圖目錄
圖1-2-1高效液相層析儀示意圖……………………….……………………3
圖1-3-1毛細管和離子層的說明圖……..……………………………………7
圖1-3-2 電滲流形成之示意圖…………..………………………..……….….8
圖1-3-3 (A) CE (B) HPLC之流型……..…………………..….…..……….….9
圖1-3-4 吸收峰的fronting與tailing示意圖……………………….….. 10
圖1-3-5 毛細管區帶電泳示意圖.………………………………….………..11
圖1-3-6 CE儀器之示意圖……………………….………….……….……12
圖1-3-7 電動力學層析原理示意圖….………………………...……………14
圖1-4-1電灑游離之過程……………………………………………………17
圖1-4-2 電灑現象…………………………………………………………..18
圖1-4-3 雷利安定極限………………………………………………………18
圖1-4-4質譜橫切面圖………………………………………………………18
圖2-1-1 黃連成分結構圖…………………………………………………..25
圖2-1-2 黃連標準品電泳圖譜……………………………………………..29
圖2-1-3 黃連藥材電泳圖譜………………………………………………..29
圖2-2-1 不同黃連萃取樣品之成分含量統計圖…………………………..43
圖2-2-2 黃連成分(生藥粉末)在去氧的固定體積人工胃液中攪拌的變化情形……………………………………………………………………………. 48
圖2-2-3 黃連成分(生藥粉末)在去氧的固定體積人工腸液中攪拌的變化情形……………………………………………………………………………. 49
圖2-2-4黃連成分(生藥粉末)在有氧的固定體積人工腸液中攪拌的變化情形……………………………………………………………………………. 50
圖2-2-5黃連成分(生藥粉末)在去氧的改變體積人工腸液中攪拌的變化情
形…………………………………………………………………………………….51
圖2-2-6黃連成分(生藥粉末)在去氧的改變體積人工腸液中振盪的變化情形……………………………………………………………………………. 52
圖2-2-7黃連成分(50%乙醇萃取樣品)在去氧的改變體積人工腸液中振盪的變化情形…………………………………………………………………. 53
圖2-2-8小白鼠尿液收集量的長條圖………………………………………56
圖2-2-9小白鼠餵食三黃瀉心湯24小時後的尿液層析圖……………….57
圖2-2-10小白鼠空白組尿液層析圖…………………………………….. 57
圖2-2-11小白鼠空白組的血清層析圖…………………………………… 58
圖2-2-12 小白鼠餵食三黃瀉心湯24小時後的血清層析圖……………. 58
圖3-1-1 黃連藥材飲片……………………………………………………. 60
圖3-1-2 磷酸二氫鉀濃度與k’值關係……………………………………. 71
圖3-1-3 pH值對k’值的影響………………………………………………. 72
圖3-1-4 氰甲烷濃度對k’值的影響……………………………………... 73
圖3-1-5 黃連標準品之層析圖……………………………………………..76
圖3-1-6 黃連藥材之層析圖………………………………………………..76
圖3-2-1 不同Sep-Pak處理之黃連分析圖譜…………………………... 86
圖3-2-2 小白鼠尿液LC圖………………………………………………… 87
圖3-2-3 小白鼠血清LC圖………………………………………………… 87
圖3-2-4黃連成分與餵食三黃混和煎煮浸膏小白鼠尿液的變化情形…..88
圖3-2-5黃連成分與餵食三黃共煎煮浸膏之小白鼠尿液的變化情形…..89
圖3-2-6黃連成分與餵食三黃50%乙醇萃取浸膏小白鼠尿液的變化形… 90
圖3-2-7黃連成分與餵食三黃混和煎煮浸膏之小白鼠血清的變化形… .91
圖3-2-8黃連成分與餵食三黃共煎浸膏之小白鼠血清的變化情形…… .92
圖3-2-9黃連成分與餵食三黃50%乙醇萃浸膏之小白鼠血清的變化形… 93
圖 4-1-1 薑黃原生植物…………………………………………………….95
圖 4-1-2 薑黃飲片………………………………………………………….95
圖 4-1-3 薑黃成分結構圖………………………………………………….97
圖4-1-4 分析管柱結構圖………………………………………………… 103
圖4-1-5 不同管柱對k’值的影響……………………………………….. 113
圖4-1-6 不同管柱與各成分N值的關係圖…………………………….. 114
圖4-1-7 磷酸二氫鉀濃度與k’值關係…………………………………. 115
圖4-1-8 磷酸二氫鉀濃度與各成分N值的關係……………………….. 116
圖4-1-9 pH值對k’值的影響……………………………………………. 117
圖4-1-10 pH值與各成分N值的關係圖……………………………….. 118
圖4-1-11 氰甲烷濃度對k’值的影響………………………………….. .119
圖4-1-11 氰甲烷濃度與各成分N值的關係…………………………… .120
圖4-1-13 不同管柱的層析圖………………………………………….. 121
圖4-1-13 流動相中不同氰甲烷/水比例的層析圖……………………. .122
圖4-1-14 薑黃成分層析圖……………………………………………… 123
圖4-2-1 添加不同比例三氟乙酸(TFA)與各成分滯留因子的關係圖…..138
圖4-2-2添加不同比例三氟乙酸與各成分理論板數關係圖…………….139
圖4-2-3流動相(B)之組成與各成分滯留因子的關係圖………………..140
圖4-2-4流動相(B)之組成與各成分理論板數的關係圖………………..141
圖4-2-5薑黃標準品層析圖……………………………………………….142
圖4-2-6薑黃條件比較圖………………………………………………… 143
圖4-2-7 薑黃HPLC、TIC、SIM圖………………………………………..146
圖4-2-8 薑黃MS圖………………………………………………………. 147
表目錄
表1-3-1 毛細管電泳層析法之發展歷程………………………………… 5
表1-3-3 毛細管電泳之分離模式………………………………………….11
表1-3-3 樣品變數對於 CE分析上的影響………………………………..16
表 2-1-1黃連成分之檢量線 ………………………………………………31
表2-1-2 黃連的定量結果…………………………………………………. 32
表2-2-1 黃連藥材用不同方法萃取的浸膏與浸率………………………. 42
表2-2-2 不同萃取樣品，換算成原藥材的萃出量及萃取率……………… 43
表2-2-3 固定體積及改變體積下，人工腸液所需的添加量…………... 46
表2-2-4 小白鼠尿液的收集量……………………………………………. 55
表3-1-1 黃連分析方法之梯度沖提程式…………………………………. 63
表3-1-2 相關製劑分析文獻………………………………………………. 66
表3-1-3 不同磷酸鹽濃度與各成分N值(N´104)的關係表………………. 68
表3-1-4 流動相(A)不同pH值與各成分N值(N´104)的關係表…………… 68
表3-1-5 不同比例之流動相(B)與各成分N值(N´104)的關係表………….69
表3-1-6 不同氰甲烷/水比例 (v/v) 的解析度Rs…………………….. 70
表3-1-7 黃連成分之檢量線…………………………………………… ….70
表3-1-8 HPLC分析條件之再現性評估……………………………………..74
表3-1-9 HPLC分析條件回收率及偵測極限………………………………..75
表3-1-10 黃連的定量結果………………………………………………… 75
表3-2-1 三黃瀉心湯組成與藥理作用……………………………………..77
表3-2-2 黃連分析方法之梯度沖提程式…………………………………..80
表3-2-3 不同Sep-pak與各成分回收率（％）關係表…………………….83
表3-2-4 尿液中餵食不同萃取浸膏各成分的最高濃度…………………. 83
表3-2-5 尿液中各成分的最高排出率（最高濃度與餵食量的面積比）…84
表3-2-6 血清中餵食不同萃取浸膏各成分的最高濃度…………………. 84
表3-2-7血清中各成分的最高吸收率(最高濃度與餵食量的面積比值)..84
表4-1-1 製備型HPLC分析方法之梯度沖提程式…………………………101
表4-1-2薑黃分析方法之梯度沖提程式………………………………..102
表4-1-3 分離管柱的種類及其材質表…………………………………. 102
表4-1-4 不同分析管柱與各成分滯留因子(k’)的關係表……………….106
表4-1-5 不同分析管柱時與各成分N值(N×104)的關係表……………….107
表4-1-6 不同分離管柱的Rs (6/7)值…………………………………….107
表4-1-7 不同同磷酸鹽濃度與各成分滯留因子(k’)的關係表………….108
表4-1-8 不同磷酸鹽濃度時與各成分N值(N×104)的關係表…………….108
表4-1-9 不同分離管柱的Rs (6/7)值…………………………………….109
表4-1-10 不同pH值與各成分滯留因子(k’)的關係表…………………..109
表4-1-11 不同pH值時與各成分N值(N×104)的關係表…………………..109
表4-1-12 不同分離管柱的Rs (6/7)值…………………………………..109
表4-1-13 不同氰甲烷/水與各成分滯留因子(k’)的關係表…………….111
表4-1-14 不同氰甲烷/水與各成分N值(N×104)的關係表……………….111
表4-1-15 不同分離管柱的Rs (6/7)值…………………………………..112
表4-1-16 薑黃成分之檢量線……………………………………………..124
表4-1-17薑黃分析條件之再現性及回收率……………………………. 125
表4-1-18 薑黃的偵測極限………………………………………………. 125
表4-1-19 薑黃的定量結果………………………………………………..125
表4-2-1 薑黃分析方法之梯度沖提方程式……………………………. 128
表4-2-2 添加不同體積三氟乙酸濃度與各成分滯留因子(k’)的關係表 131
表4-2-3 加入不同體積三氟乙酸與各成分N值(N×104)的關係表………132
表4-2-4 加入不同體積三氟乙酸與各成分的Rs(1/2) (6/7)值……… 132
表4-2-5 不同比例之流動相(B)與各成分滯留因子(k’)的關係表…… ..133
表4-2-6 不同比例之流動相(B)與各成分N值(N×104)的關係表………..134
表4-2-7 不同甲醇/氰甲烷/三氟乙酸比例與各成分的Rs(1/2)(6/7值..135
表4-2-8 薑黃成分之檢量線……………………………………………….135
表4-2-9薑黃分析條件之再現性及回收率……………………………….136
表4-2-10薑黃的偵測極限………………………………………………… 137
表5-1-1 HPLC與CE的比較………………………………………………….148
表5-3-1 尿液中各成分的最高排出率（最高濃度與餵食量的面積比）..150
表5-3-2 血清中各成分的最高吸收率（最高濃度與餵食量的面積值）..150
表5-4-1薑黃藥材之 HPLC 分析方法比較………………………………..151
表5-4-2 HPLC分析條件適宜性的評估…………………………………..152

參考文獻
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