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研究生:陳嬿伊
論文名稱:蛹蟲草發酵液及其區分物對肝細胞之影響
論文名稱(外文):The effects of the fractions of submerged culture of Cordyceps militaris on hepatocytes
指導教授:蔣丙煌蔣丙煌引用關係沈立言沈立言引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:食品科技研究所
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2002
畢業學年度:90
語文別:中文
論文頁數:127
中文關鍵詞:蛹蟲草發酵機能性成份腺甘蟲草素麥角固醇蟲草酸初代肝細胞
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本論文首先探討蛹蟲草於液態發酵時之生長情形及所生產之機能性成分。結果發現在低溶氧量之環境下,菌絲體在第四天產量達最高(4.95 mg/mL) ,pH值亦在第二天至第四天中有較明顯下降的趨勢。在發酵期間麥角固醇於第四天(13.8 ppm)逐漸累積並於第六天達到最高濃度17.29 ppm;腺苷含量大致上與菌絲體乾重呈正比,因其為細胞構成物質,故會隨著菌絲體的增加而上升。蟲草素於第五天達最高量61.1 ppm;蟲草酸於第4天大量累積至最高量1.39 mg/mL。菌絲體生成量影響發酵液中一級、二級代謝產物,而和發酵條件所提供之溫度、溶氧量、培養基之碳氮比有很大的關連,若基於以機能性成份含量多寡為產品訴求,則需考量不同之發酵條件對於發酵產物之影響。
利用膜分離技術將發酵液區分成三個區分物。各區分物中以分子量小於3 kD者(LMWCO)收率達86.9 %為最高,可知發酵液(Broth)中之組成大部分為分子量較小之物質。分子量介於3-10 kD之區分物收率最低(1.9 %),但大部分蛋白質集中於此,可知蛹蟲草發酵液之蛋白質組成之分子量並不高,為小分子蛋白質或大胜肽;而分子量大於10 kD的區分物應含多醣或少部分醣蛋白質。分子量小於3 kD部份之胺基酸以glutamic acid (1.44 %)、glycine (1.44 %)及aspartic acid (1.07 %)含量最高;分子量介於3-10 kD則因含高量之 glycine、glutamic acid、proline。而分子量小於3 kD之游離胺基酸以tyrosine、methionine、aspartic acid及arginine含量較高。
在大鼠初代肝細胞實驗方面,肝細胞以200 μL/mL 以下之添加量對肝細胞無損傷;200 μL/mL以上之Broth及LMWCO處理,可能導致細胞內麩胱甘肽(GSH)生合成系統遭受破壞或抑制,使得胞內麩胱甘肽生成量明顯的降低,造成細胞損傷、細胞膜破裂而使乳酸去氫酶滲漏率明顯升高,並使胞內部分麩胱甘肽流失到細胞外或耗盡,導致細胞生存力下降。添加高濃度之蛹蟲草發酵液時,無法有效抑制脂質過氧化作用的發生,而高濃度(200、400 μL/mL)之LMWCO,無論對於肝細胞之生存力的傷害及過氧化情形,均較Broth更嚴重;此外當LMWCO添加量達400 μL/mL時,顯著抑制GSH相關酵素之活性。
雖然由本實驗之正常肝細胞結果看來,蛹蟲草發酵液及其小分子量之區分物無法有效提高肝細胞解毒代謝及抗氧化之效果,但就另一方面而言,發酵液中因含有二次代謝物-蟲草素,此種液體區分可以有效抑制癌細胞的生長。
目 錄 頁次
中文摘要…………………………………………………………I
Abstract…………………………………………………………III
目錄………………………………………………………………V
圖目錄……………………………………………………………X
表目錄……………………………………………………………XI
壹、前言…………………………………………………………1
貳、文獻整理……………………………………………………3
一、蟲草屬的介紹…………………………………………… 3
1. 蟲草屬的簡介……………………………………………… 3
1.1 蟲草屬的研究簡史…………………………………………3
1.2 蟲草屬的分類地位…………………………………………4
1.3 蟲草的形成…………………………………………………5
2. 蟲草屬的成份……………………………………………… 6
2.1 一般化學成分………………………………………………6
2.2 胺基酸組成…………………………………………………6
2.3 多醣組成……………………………………………………7
2.4 核苷酸………………………………………………………9
2.5 麥角固醇(ergosterol) …………………………………12
2.6 蟲草酸(cordycepic acid)(D-mannitol)………………15
3. 藥理功能……………………………………………………16
3.1 抗癌作用………………………………………………… 16
3.2 降低血糖作用…………………………………………… 16
3.3 降低三酸甘油酯作用…………………………………… 17
3.4 血小板凝集抑制作用…………………………………… 17
3.5 治療冠狀動脈心臟病、腦血管疾病…………………… 17
3.6 降血壓作用……………………………………………… 17
3.7 保肝作用………………………………………………… 18
3.8 鎮靜作用………………………………………………… 18
3.9 抗菌作用………………………………………………… 18
3.10 免疫作用…………………………………………………19
3.11 平喘作用…………………………………………………19
二、液態發酵技術之介紹…………………………………… 20
1. 人工培養蟲草屬之發展………………………………… 20
2. 液態發酵技術………………………………………………21
三、膜分離技術……………………………………………… 23
四、初代肝細胞實驗及其相關測定………………………… 28
1. 灌注配合動物細胞培養技術………………………………28
2. 脂質過氧化機制及其對生物體的影響……………………30
2.1 脂質過氧化之作用機制………………………………… 31
2.2 氧化壓力對生物體之影響……………………………… 33
2.3 麩胱甘肽(glutathione)-內源性之主要抗氧化物.… 37
參、實驗架構………………………………………………… 42
一、原料製備與分離………………………………………… 42
二、大鼠初代肝細胞之培養………………………………… 43
三、機能性成份分析………………………………………… 44
肆、材料與方法……………………………………………… 45
一、實驗材料………………………………………………… 45
1. 蛹蟲草液態發酵液之製備…………………………………45
1.1 蛹蟲草菌株……………………………………………… 45
1.2 培養基…………………………………………………… 45
1.3 培養時需用之儀器……………………………………… 45
2. 發酵產物之分離區分………………………………………46
2.1 藥品……………………………………………………… 46
2.2 儀器……………………………………………………… 46
3. 機能性成份分析……………………………………………47
3.1 藥品……………………………………………………… 47
3.2 儀器……………………………………………………… 47
4. 大鼠初代肝細胞之培養……………………………………48
4.1 實驗動物飼養…………………………………………… 48
4.2 藥品……………………………………………………… 49
4.3儀器…………………………………………………………49
二、實驗方法………………………………………………… 52
1. 蛹蟲草之發酵培養…………………………………………52
1.1 菌種活化………………………………………………… 52
1.2 種菌製備………………………………………………… 52
1.3 液態培養(種培養)……………………………………… 52
1.4 5L發酵槽深層培養(本培養)…………………………… 53
1.5 菌絲體乾重分析………………………………………… 53
1.6 還原糖測定……………………………………………… 53
1.7 發酵液前處理…………………………………………… 54
2. 發酵液之分離及萃取………………………………………54
2.1 菌絲體之萃取…………………………………………… 54
2.2 液體部份之區分………………………………………… 55
3. 機能性成份分析……………………………………………56
3.1胺基酸含量分析……………………………………………56
3.2 腺苷(adenosine)及蟲草素(cordycepin)濃度之分析…56
3.3 麥角固醇(ergosterol)含量之分析…………………… 59
3.4 蟲草酸(cordycepic acid) (mannitol)含量之分析… 61
4. 蛹蟲草發酵物之不同區分對初代肝細胞生理機能之影響63
4.1 初代肝細胞之分離、計數……………………………… 63
4.2 樣品之處理……………………………………………… 65
4.3 大鼠初代肝細胞生存力之分析………………………… 66
4.4 脂質過氧化作用(lipid peroxidation)之測定……… 67
4.5 麩胱甘肽(glutathione, GSH)含量之分析…………… 68
4.6麩胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GPx)活性之分析……………………………………………………………… 69
4.7 麩胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GRd)活性之分析……………………………………………………………… 71
4.8 麩胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase, GRd)活性之分析……………………………………………………………… 71
4.9 統計分析………………………………………………… 72
伍、結果與討論……………………………………………… 73
一、 5 L發酵槽之深層培養………………………………… 73
1.1 DO值………………………………………………………74
1.2 pH值之變化………………………………………………74
1.3 還原糖含量的變化………………………………………74
1.4 菌絲體的變化…………………………………………… 75
二、 機能性成份之分析………………………………………78
2.1 麥角固醇(ergosterol)含量的變化…………………… 78
2.2 腺苷(adenosine)及蟲草素(cordycepin)含量的變化…81
2.3 蟲草酸(cordycepic acid)含量的變化…………………84
三、 發酵產物之膜分離加工…………………………………87
3.1 反覆稀釋式濾析 (Sequential dilution diafiltration)
……………………………………………………………87
3.2 發酵液區分物之收率…………………………………… 88
3.3 發酵液區分物之胺基酸組成…………………………… 90
四、 蛹蟲草發酵液及其區分物在大白鼠初代肝細胞之生理活性
……………………………………………………………95
1. 蛹蟲草發酵液及其區分物對肝細胞生存力之影響………95
2. 蛹蟲草發酵液及其區分物對肝細胞脂質過氧化作用……99
3. 蛹蟲草發酵液及其區分物對肝細胞麩胱甘肽濃度與抗氧化系統
及解毒代謝能力之影響……………………………… 102
4. 蛹蟲草發酵液及其區分物對肝細胞中麩胱甘肽相關代謝酵素之
影響…………………………………………………… 107
5. 不同蛹蟲草發酵液及其區分物之添加量對大白鼠初代肝細胞生
理活性之評估………………………………………… 114
五、 蛹蟲草發酵液及其區分物對肝腫瘤細胞之影響…… 115
陸、結 論……………………………………………………118
柒、參考文獻…………………………………………………120
圖 次 頁數
圖一、 天然冬蟲夏草及蛹蟲草……………………………… 4
圖二、 腺苷及蟲草素之化學結構…………………………… 11
圖三、 麥角固醇之之化學結構……………………………… 13
圖四、 麥角固醇於真菌細胞中之合成過程………………… 14
圖五、 蟲草酸之化學結構…………………………………… 15
圖六、 常見之發酵槽種類…………………………………… 22
圖七、 攪拌式反應器………………………………………… 23
圖八、 脂質過氧化作用之過程……………………………… 33
圖九、 自由基傷害細胞之機轉……………………………… 38
圖十、 活性氧之形成與代謝………………………………… 40
圖十一、 麩胱甘肽系統所扮演之抗氧化角色……………… 41
圖十二、 腺苷之標準曲線圖………………………………… 58
圖十三、 蟲草素之標準曲線圖……………………………… 58
圖十四、 麥角固醇之標準曲線圖…………………………… 60
圖十五、 蟲草酸之標準曲線圖……………………………… 62
圖十六、 葡萄糖之標準曲線圖……………………………… 62
圖十七、 發酵過程中pH值、溶氧值、還原糖之變化……… 75
圖十八、 比較蛹蟲草發酵液於培養期間菌絲體乾重及麥角固醇
含量之變化…………………………………………77
圖十九、 麥角固醇之HPLC層析圖(A)標準品層析圖(B)發酵樣品
層析圖………………………………………………80
圖二十、 腺苷及蟲草素之HPLC層析圖(A)標準品層析圖(B)發酵
樣品層析圖…………………………………………82
圖二十一、 蛹蟲草發酵液於培養期間腺苷及蟲草素含量變化..83
圖二十二、 蟲草酸及葡萄糖之HPLC層析圖(A)標準品層析圖(B)
發酵樣品層析圖…………………………………85
圖二十三、 蛹蟲草發酵液於培養期間蟲草酸含量的變化… 86
圖二十四、 蛹蟲草發酵液之超過濾膜區分物之收率……… 89
圖二十五、 不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代
肝細胞乳酸去氫酶滲漏率之影響………………97
圖二十六、 不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代
肝細胞形態之影響………………………………98
圖二十七、 不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代
肝細胞中脂質過氧化形態之影響………………100
圖二十八、 不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代
肝細胞內麩胱甘肽濃度之影響…………………104
圖二十九、不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代肝
細胞中麩胱甘肽過氧化酶活性之影響…………108
圖三十、不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代肝細
胞中麩胱甘肽還原酶活性之影響………………110
圖三十一、不同濃度之蛹蟲草發酵液及其區分物對大白鼠初代肝
細胞中麩胱甘肽硫轉移酶活性之影響…………112
圖三十二、 以蛹蟲草發酵液液體區分物抑制Hep G2 細胞生長情
形…………………………………………………117
表 次 頁數
表一、 發酵液經濾析後滯留液之含糖量………………………88
表二、 蛹蟲草發酵液之各液體區分物總胺基酸含量…………91
表三、 蛹蟲草發酵液之各液體區分物游離胺基酸含量………94
表四、 以蛹蟲草發酵液液體低分子量區分物抑制 Hep G2 細胞
生長情形……………………………………………116
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