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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:謝議範
研究生(外文):Yi-Fan Shieh
論文名稱:以融合微滴電噴灑游離質譜法消除蛋白質分析時有機鹽類和界面活性劑所造成的干擾
論文名稱(外文):Eliminating Interference of Organic salt and Surfactant in Protein Analysis by Fused-Droplet Electrospray Ionization Mass Spectrometry
指導教授:謝建台
指導教授(外文):Jentaie-Shiea
學位類別:碩士
校院名稱:國立中山大學
系所名稱:化學系研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2003
畢業學年度:91
語文別:中文
論文頁數:64
中文關鍵詞:蛋白質電噴灑游離法界面活性劑融合微滴電噴灑游離質譜法有機鹽類
外文關鍵詞:Organic saltFD-ESI/MSESISurfactantprotein
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論 文 摘 要
一般的生化樣品其本身均含有大量的鹽類(如人體中的鈉鹽、鉀鹽等);而在前處理的過程中也常常添加一些鹽類和界面活性劑用來純化。以傳統的電噴灑游離質譜法(electrospray ionization mass spectrometry, ESI/MS)進行生化樣品的分析時,這些鹽類的存在除了會造成電噴灑現象不穩定、背景訊號提昇、分析物離子訊號減弱或消失外,也易和分析物分子形成加成離子造成質譜圖判讀的困難。所以使用ESI/MS在分析生化樣品前,須先進行去除鹽類等干擾物的步驟,而這些處理過程繁瑣且會消耗多量藥品或成本。
本論文的研究目的主要是利用融合微滴電噴灑游離質譜法(Fused- Droplet Electrospray Ionization Mass Spectrometry, FD-ESI/MS),以簡單且快速的方式,去除分析樣品中含有有機鹽類(如界面活性劑、生化用的緩衝溶液)對質譜偵測分析上所遇到的干擾現象。此方法主要是將樣品的游離與霧化部分分開,分析物經由霧化器霧化之後形成微滴,藉由輔助氣流的吹送帶至霧化器前端出口;再由電噴灑游離源產生的帶電液滴與霧化液滴進行融合,產生帶有電荷的分析物最後進入質譜儀中進行偵測。而過程中因為鹽類干擾物與有機溶劑之間具有極性差異,所以在進行融合的過程中無法有效的與電噴灑帶電液滴產生融合,形成帶電的氣相離子,故在實驗中便利用此一重要的特性去除鹽類存在分析物所產生的干擾。
在本實驗的結果顯示,當樣品中含有10-1M之生化常用的緩衝溶液-TRIS(2- amino-2- hydroxymethyl -1,3-propanediol)干擾物時,利用融合微滴電噴灑游離質譜法仍然可以觀察到蛋白質的多價電荷訊號,而以傳統的電噴灑游離質譜法在相同的濃度下只能得到TRIS 的clusters訊號。而除了蛋白質分析物外,利用此法在小分子如胜肽、藥物分子上亦有去除干擾的效果。配合ion-pair的方式可以觀察到,即使在樣品中含有等濃度(10-2M)的陰離子(sodium dodecyl sulfate, SDS)與陽離子(cetyltrimethylammomium bromide, CTAB)界面活性劑,以FD-ESI/MS的方法仍然可以觀察到蛋白質多價電荷訊號。由所得實驗結果,可以證明使用FD-ESI/MS可得到比傳統的ESI/MS高的干擾物容忍極限,更使得生化樣品分析的前處理過程大量的簡化。
目 錄
摘 要………………………………………………………………………….i
目 錄………………………………………………………….………………iii
圖目錄……………………………………………………….…………………vi
表目錄…………………………………………………………….…………..viii

壹、緒論…………………………………………………………………………1
一、 前言………………………………………………………………………1
二、 電噴灑游離質譜法的介紹……………………………………..………...3
1. 電噴灑游離質譜游離法的沿革………………………………..….…...3
2. 電噴灑游離質譜法的原理與反應機構……………………….………4
(1) 帶電液滴的形成…………………………………….….…….....4
(2) 帶電液滴的揮發與液滴的爆裂…………………..…....……....5
(3) 氣相多價電荷離子的產生………….………………..…………6
三、 融合微滴電噴灑游離質譜法的發展……………………………………8
四、 鹽類在質譜分析上的影響……………………………..……….………12
1. 生物體中鹽類的存在與質譜偵測的干擾現象…………..………….12
2. 鹽類中之界面活性劑的介紹…………………………….....…….….13
(1)界面活性劑的定義……………………………………………13
(2)界面活性劑的種類…………………………………….……...13
(3)界面活性劑的性質…………………...………………...……..15
3. 傳統在生化分析上去除鹽類干擾的方法…………………….……..15
五、論文目標…………………………………………………………………..17

貳、 實驗………………………………………………….…………….…….18
一、 儀器裝置………………………………..……………………………18
1. 融合微滴電噴灑游離源……………………………………………18
2. 微量注射幫浦………………………………………………………18
3. 質譜儀………………………………………………………………18
二、試劑及藥品…………………………………………………………….20
1. 試劑………………………………………………………………….20
2. 藥品………………………………………………………………….20
三、融合微滴電噴灑游離質譜法的組裝…………………………………..22
1. 分析物霧化裝置………………..………………………….………22
2. 電噴灑游離源裝置……………..………………………………….23
四、實驗操作流程……………………………..………………………..…..24

參、 結果與討論…………………………………………………………...….25
一、 以融合微滴電噴灑游離質譜法去除陰離子型界面活性劑的干擾……………………………………………..………………..…..…26
1. 分析樣品-蛋白質………………………………………..………28
2. 分析樣品-胜肽…………………………………………………..36
3. 分析樣品-藥物分子……………………………………………..38
二、以融合微滴電噴灑游離質譜法去除陽離子型界面活性劑的干擾………………………………………………………………………44
三、以Ion-pair的方式結合融合微滴電噴灑游離質譜法去除陽離子及陰離子界面活性劑的干擾…………………………………………………46
四、以融合微滴電噴灑游離質譜法去除非離子型界面活性劑的干擾………………………………………………………………………49
五、以融合微滴電噴灑游離質譜法去除生化上緩衝溶液與有機添加物的干擾…………………………………………………………………..51
1. TRIS buffer……………………………………..……….……….….…51
2. DTT…………………………………………………………………….54
肆、 結論………………………………………………..…………….………59

伍、 參考資料…………………………………..………………………….…61

圖目錄

圖 1. (a)電噴灑游離質譜法(ESI/MS)裝置與(b)游離原理…….….5
圖 2. 離子揮發理論示意圖……...…………………………………………..7
圖 3. 融合微滴電噴灑游離質譜法(FD-ESI/MS)的原始裝置圖………. 11
圖 4. FD-ESI/MS之裝置示意圖…………………………………………...22
圖 5. FD-ESI/MS的可能融合機制……….………………..….….…...…...24
圖 6. 以FD-ESI/MS去除分析物中界面活性劑干擾的反應機制…….….25
圖 7. 以ESI/MS偵測蛋白質分析物中含有不同濃度的陰離子界面活性劑J………………………………………………………………………..29
圖 8. 以FD-ESI/MS偵測含有陰離子界面活性劑的蛋白質溶液……..…31
圖 9. 以FD-ESI/MS結合改變電噴灑溶液組成來偵測含有陰離子界面活性劑(SDS)的蛋白質(肌紅蛋白)溶液………………………..…32
圖10. 以FD-ESI/MS偵測含有不同濃度SDS的細胞色素c溶液…….…35
圖11. 分別以(a)ESI/MS ;(b)FD-ESI/MS 10-3M SDS的bradykinin(5x10-5M)溶液……………………………………………………37
圖12. 以ESI/MS偵測含有不同濃度SDS的slidenafil citrate溶液…..……39
圖13. 以FD-ESI/MS偵測含有不同濃度SDS的slidenafil citrate溶液….40
圖14. 分別(a)以ESI/MS;(b)FD-ESI/MS改變電噴灑組成來偵測含有10-3M SDS的slidenafil citrate(10-7M)溶液………………….……42
圖15. 分別(a)以ESI/MS;(b)FD-ESI/MS偵測含有不同濃度的陽離子界面活性劑(CTAB)的肌紅蛋白溶液………………………..….45
圖16. 以Ion-pair方式去除界面活性劑干擾的可能反應機構………....…46
圖17. 利用Ion-pair方式結合(a)ESI/MS;(b)FD-ESI/MS偵測含有SDS與CTAB混合溶液的的肌紅蛋白……………….…………………...48
圖18. 以(a)ESI/MS;(b)FD-ESI/MS 偵測含有不同濃度PEG600的肌紅蛋白…………………………………………………………...…….50
圖19. 以ESI/MS偵測含有不同濃度TRIS的肌紅蛋白……………..…….52
圖20. 以FD-ESI/MS偵測含有不同濃度TRIS的肌紅蛋白…..……….…53
圖21. 以ESI/MS偵測含有不同濃度DTT的細胞色素c…………………55
圖22. 以FD-ESI/MS偵測含有不同濃度DTT的細胞色素c………………58

表目錄
表1、常見有機溶劑的極性指數表…………………………………………..27
伍、參 考 文 獻

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