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研究生:陳宏美
研究生(外文):Hung-Mei Chen
論文名稱:ApoE型脂蛋白胺基端和羧基端的製備表達與純化
論文名稱(外文):Construction,Expression and Purification of the N-terminal and C-terminal domain of the ApoE
指導教授:黃憲斌
學位類別:碩士
校院名稱:國立中正大學
系所名稱:分子生物研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
中文關鍵詞:ApoE 型脂蛋白
外文關鍵詞:ApoE
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血漿中含有許多脂蛋白而ApoE是其中的一種,它全長有299個胺基酸,分子量約34kDa。它可在許多器官中被合成,其中以肝臟為主。ApoE參與脂蛋白及膽固醇的運送和清除,在人體代謝上扮演了很重要的角色。除了肝臟外,ApoE也可在腦中製造,並釋放於腦中進而參與神經元的再生與修復。已知人類ApoE共有三種多型異構物,分別為ApoE2、ApoE3和ApoE4,其中以ApoE3最普遍,根據統計血液中含有高三酸甘油脂的病患中,以ApoE2表現型的人佔最多;然而血液中含有高血膽固醇以及心血管方面的疾病,則好發於ApoE4表現型的人。
目前已知ApoE除了參與前述的代謝外,ApoE也與阿茲海默症中的老人斑有結合作用,而ApoE4基因型佔晚發性阿茲海默症患者比例最高。ApoE含有兩個結構功能區域,分為胺基端區域和羧基端區域,胺基端區域含有脂蛋白接收器結合位置,經由X-ray晶體繞射結構分析此區域是由四束螺旋結構以反平行的方式排列而構成;羧基端區域則含有脂質結合位置,但由於羧基端區域自己本身會聚集,因此無法透過X-ray晶體繞射結構分析確切得知其實際結構,但一般預估它是由高度α螺旋結構所組成。證據顯示ApoE這兩個結構區域彼此間會互相作用,進而影響到ApoE的生化特性,因此本實驗目的在於利用E.coli大量表達ApoE羧基端區域,以提供NMR進行結構研究。

Apolipoprotein E (ApoE) is a plasma apolipoprotein of 299 amino acids (Mr 34,000 ) that is primarily synthesized in livers. ApoE plays an important role in lipoprotein transport and cholesterol clearance. ApoE is also produced and secreted in the brain and is believed to participate in neuronal regeneration. Three ApoE isoforms, i.e. ApoE2, ApoE3, and ApoE4, have been identified in human being. The most common isoform is ApoE3. A higher prevalence of ApoE2 was observed in hypertriglyceridemic patients, while ApoE4 was noted in hypercholesterolemic patients.
ApoE has been proven to influence its metabolic properties. Recent studies have revealed that ApoE interacts with the senile plaque in the brains of Alzheimer disease. The frequency of ApoE4 isoform is significantly higher in the population of late-onset Alzheimer disease. The previous studies have shown that ApoE contains two structural domains, the NH2-terminal and the COOH-terminal domains. The NH2-terminal domain contains the lipoprotein receptor binding region and consists of a four-helix bundle with antiparallel arrangement. The COOH-terminal domain contains the lipoprotein (lipid) binding site. The structure of the COOH-terminal domain of ApoE, however, is unknown, but is supposed to be highly amphipathic α-helices. The interaction between N-terminal and C-terminal domains of ApoE has been proven to influence its biochemical properties. The purpose of this study is aimed to express and purify a large amount of ApoE COOH-terminal domain in E.coli through non labeled or labeled-medium followed by investigating its structure by NMR studies.

摘要……………………………………………………………………….i
英文摘要…………………………………………………………………ii
目錄……………………………………………………………………...iii
圖表目錄…………………………………………………………………v
第一章 緒論……………………………………………………………..1
1-1 背景介紹………………………………………………………….1
1-2 研究動機………………………………………………………...12
第二章 實驗材料與方法………………………………………………14
2-1 實驗材料………………………………………………………...14
2-1.1 實驗材料與藥品……………………………………………14
2-1.2 蛋白質表達培養基配方……………………………………14
2-1.3 緩衝溶液的配置……………………………………………16
2-1.4 Ni2+-column的配置…………………………………………17
2-1.5 Blue-Sepharose的配置……………………………………...17
2-2 實驗方法………………………………………………………...18
2-1.1表達ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質……………….18
2-1.2表達不同標定物標定的ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質…………………………………………………20
2-2.2a製備Non-labeled ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質……………………………………………..20
2-2.2b製備15N-labeled ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質……………………………………………..20
2-2.2c製備15N, 13C-labeled ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質……………………………………………..21
2-2.2d製備15N, 13C, 2H-labeled ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質……………………………………………..21
2-2.2e製備15N, 2H-labeled glucose(C6D6), 2H-label(D2O)
ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質…………………22
2-2.3 ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質之純化……………22
第三章 實驗結果………………………………………………………25
3-1表達未標定與不同標定物標定ApoE型脂蛋白羧基端之
融合蛋白質的結果………………………………………………25
3-2純化未標定的ApoE型脂蛋白羧基端
蛋白質的結果…………………………………………………....25
3-3純化各種不同標定的ApoE型脂蛋白羧基端
蛋白質的結果……………………………………………………27
第四章 討論……………………………………………………………37
第五章 參考文獻………………………………………………………40
圖表目錄
圖一 人類ApoE3全長之胺基酸序列…………………………………7
圖二 ApoE sturctural domain示意圖…………………………………..8
圖三 ApoE3和ApoE4 N-terminal structural domain之
X-ray晶體繞射圖………………………………………………...9
圖四 阿茲海默症病人腦神經細胞圖…………………………………10
表一 ApoE isoform不同處及其生化特性……………………………11
附圖一 ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質
經Thrombin protease切割後示意圖…………………………28
附圖二 標定與未標定的ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質
在E.coli中的表達圖………………………………………….29
附圖三 ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質經
Ni2+-column純化之結果………………………………………30
附圖四 ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質經
Blue-Sepharose純化之結果…………………………………..32
附圖五 ApoE型脂蛋白羧基端之融合蛋白質經
Thrombin protease切割的結果……………………………….34
附圖六 利用Ni2+-column純化切割後的
ApoE型脂蛋白羧基端蛋白質之結果………………………..35
附圖七 利用Mass來確定Thrombin切割後的
ApoE型脂蛋白羧基端蛋白質之結果………………………..36

Mahley, R . W., Innerarity, T. L., Rall, S. C., Jr ., & Weisgraber, K. H. (1984) : Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function. J. Lipid Res. 25, 1277-1294.
Rall, S. C., Jr., Weisgraber, K. H. & Mahley, R. W. (1982) J. Biol. Chem. 257, 4171-4178.
Das, H. K., McPherson, J., Bruns, G. A. P., Karathanasis, S. K. &Breslow, J. L. (1985): Isolation, Characterization, and Mapping to Chromosome 19 of the Human Apolipoprotein E Gene. J. Biol. Chem. 260, 6240-6247.
Utermann, G., Steinmetz, A. & Weber, W. : Genetic control of human apolipoprotein E polymorphism (1982): comparison of one- and two-dimensional techniques of isoprotein analysis. Hum. Genet. 60, 344-351.
Menzel, H. J., Kladetzky, R. G. & Assmann, G. (1983): Apolipoprotein E polymorphism and coronary artery disease. Arteriosclerosis 3, 310-315.
Hallman, D. M., E. Boerwinkle, N. Saha, N., C. Sandholzer, H. J. Menzel, A. Csázá, & G. Uterman. (1991): The apolipoprotein E polymorphism: a comparison of allele frequencies and effects in nine populations. Am. J. Hum. Genet. 49:338-349
Weisgraber, K. H., Rall, S. C., Jr., & Mahley, R. W. (1981): Human E apoprotein heterogeneity. Cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms. J. Biol. Chem. 256, 9077-9083.
Assmann, G., G. Schmitz, H-J. Menzel, & H. Schulte. (1984): Apolipoprotein E polymorphism and hyperlipidemia. Clin. Chem. 30: 641-643.
Aggerbeck, L. P., Wetterau, J. R., Weisgraber, K. H., Wu, C.-S. C., & Lindgren, F. T. (1988): Human apolipoprotein E3 in aqueous solution. II. Properties of the amino- and carboxylterminal domains. J. Biol. Chem. 263, 6249—6258.
Wetterau, J. R., Aggerbeck, L. P., Rall, S. C., Jr., & Weisgraber, K. H. (1988): Human apolipoprotein E3 in aqueous solution. I. Evidence for two structural domains. J. Biol. Chem. 263, 6240—6248.
Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Harder, K. J., Mahley, R . W., Miline, R. W., Marcel, Y. L., & Sparrow, J. T. (1983) : The receptor-binding domain of human apolipoprotein E. Monoclonal antibody inhibition of binding. J. Biol. Chem. 258, 12348-12354.
Westerlund, J. A., & Weisgraber, K. H (1993): Discrete carboxyl-terminal segements of apolipoprotein E mediate lipoprotein association and preotein oligomerization. J. Biol. Chem. 268, 15745-15750.
Wilson, C., Wardell, M. R., Weisgraber, K. H., Mahley, R . W., & Agard, D. A. (1991): Three-dimensional structure of the LDL receptor-binding domain of human apolipoprotein E. Science 252, 1817-1822.
Mahley, R. W. (1988): Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science. 240, 622-628.
Gregg, R. E., Zech, L. A,, Schaefer, E. J., Stark, D., Wilson, D., & Brewer, H.B., Jr. (1986) :Abnormal in vivo metabolism of apolipoprotein E4 in human. J. Clin. Inuest. 78, 815-821
Steinmetz, A., Jakobs, C., Motzny, S., & Kaffarnik, H. (1989) : Differential distribution of apolipoprotein E isoforms in human plasma lipoproteins. Arteriosclerosis 9, 405-411
Dong, L.-M., Wilson, C., Wardell, M. R., Simmons, T., Mahley, R . W., Weisgraber, K. H., & Agard, D. A. (1994) : Human apolipoprotein E. Role of Arginine 61 in mediating thr lipoprotein preferences of the E3 and E4 isoforms. J. Biol. Chem. 269, 22358-22365
Ignatius, M. J., Gebicke-Härter, P. J., Skene, J. H. P., Schilling, J. W., Weisgraber, K. H., Mahley, R . W. & Shooter, E. M. (1986): Expression of apolipoprotein E during nerve degeneration and regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1125-1129.
Boyles, J., Pitas, R. E., Wilson, E., Mahley, R . W. & Taylor, J. M. (1985): Apolipoprotein E associated with astrocytic glia of the central nervous system and with non-myelinating glia of the peripheral nervous system. J. Clin. Invest. 76, 1501-1513.
Elshourbagy, N. A., Liao, W. S., Mahley, R . W. & Taylor, J. M. (1985): Apolipoprotein E mRNA is abundant in the brain and adrenals, as well as in the liver, and is present in other peripheral tissues of rats and marmosets.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 203-207.
Diedrich, J. F., Minnigan, H., Carp, R. I., Whitaker, J. N., Race, R., Frey, W., & Haase, A. T. (1991): Neuropathological changes in scrapie and Alzheimer's disease are associated with increased expression of apolipoprotein E and cathepsin D in astrocytes. J. Virol. 65, 4759-4768.
Namba, Y., Tomonaga, M., Kawasaki, H., Otomo, E.& Ikeda, K. (1991) : Apolipoprotein E immunoreactivity in cerebral amyloid deposits and neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease and kuru plaque amyloid in Creutzfeldt-Jakob disease. Brain Res. 541, 163-166.
Khachaturian, Z. S. (1984): Diagnosis of Alzheimer's disease. Arch. Neurol. 42, 1097-1105.
Eanes E.D., Glenner G.G., (1968): X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J Histochem Cytochem. 16, 673-677.
Kang J., Lemaire H. G., Unterbeck A., Salbaum J. M., Msters C. L., Grzeschik K-H, Multhaup G., Beyreuther K., & Muller-Hill B. (1987): The precursor of Alzheimer’s disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature 325, 733—736
Strittmatter, W. J., Saunders, A. M., Schmechel, D., PetericakVance, M., Enghild, J., Salvesen, G. S., & Roses, A. D. (1993): Apolipoprotein E: High-avidity binding to β-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 1977-1981.
Ladu, M. J., Falduto, M. T., Manelli, A. M., Reardon, C. A., Getz, G. S., & Frail, D. E. (1994): Isoform- specific binding of apolipoprotein E toβ-Amyloid. J. boil. Chem. 269, 23403-23406.
Ladu, M. J., Pederson, T. M., Frail, D. E., Reardon, C. A., M. J., Getz, G. S., & Falduto, M. T. (1995): Purification of apolipoprotein E attenuates isoform-specific binding toβ-Amyloid. J. boil. Chem. 270, 9039-9042..
Pillot T, Goethals M, Najib J, Labeur C, Lins L, Chambaz J, Brasseur R, Vandekerckhove J, Rosseneu M. (1999):β-amyloid peptide interacts specifically with the carboxy-terminal domain of human apolipoprotein E: relevance to Alzheimer's disease. J. Neurochem. 72, 230-237.

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11. 陳雅慧,「後兩岸關係時代來臨」,天下雜誌,2000年1月號﹙2000年1月﹚,頁46-48。
12. 程世娟,「中國大陸銀行業經營概況分析﹙上﹚」,今日合庫,總326期﹙2002年2月﹚,頁20-50。
13. 溫文錫,「我銀行業赴大陸籌設據點的可行性研究」,彰銀資料,第43卷第2期﹙1994年2月﹚,頁3-8。
14. 湯慶玲,「我國加入WTO對銀行業經營的影響」,今日合庫,總331期﹙2002年7月﹚,頁20-44。
15. 黃鈴翠,「銀行海外分行經營管理研析﹙上﹚」,今日合庫,第21卷第4期﹙1995年4月﹚,頁13-26。
 
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