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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:黃明宗
研究生(外文):Ming-Zong Haung
論文名稱:等電點聚焦電泳(IEF)結合毛細管層析質譜法(μ-HPLC/MS)分析血清中微量蛋白質
論文名稱(外文):Micro-Isoelectric Focusing Electrophoresis Coupled with Capillary HPLC / MS to Analyze Trace Amount of Proteins in Human Serum
指導教授:謝建台
指導教授(外文):Jentaie Shiea
學位類別:碩士
校院名稱:國立中山大學
系所名稱:化學系研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:90
中文關鍵詞:梯度毛細管層析血清等電點聚焦電泳兩性物質等電點
外文關鍵詞:isoelectric focusingisoelectric pointserumgradientampholyteμ-HPLC
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在生物體中不同的蛋白質會有不同的等電點(Isoelectric Point, pI),而等電點聚焦(Isoelectric Focusing, IEF)是在電泳槽中施加一高電壓,使Ampholyte Buffer 形成一個穩定的pH gradient分布;當蛋白質處在不同pH值環境中,在電場的作用下會遷移並聚焦到各自的等電點,故可達到分離效果。IEF是一項廣泛運用的蛋白質分離技術,一般而言,可將等電點相差0.01∼0.02 pH單位的蛋白質分離,具有相當高的解析度。
而商業化的IEF裝置,由於buffer及sample用量大,然一般的生化樣品量少且取之不易,故本實驗所發展出的微小化等電點聚焦裝置即在解決此項缺點。實驗裝置是以壓克力板組合而成,其長寬約為10㎝ × 1㎝,在內部以PTFE (polypropylene backed)薄膜(孔徑為0.5 μm)將溝槽分別區隔成10、20及50個不同區段,來進行水溶液系統中蛋白質初步分離,而實驗所使用buffer的量約在5~10 mL,sample的量則小於100 μL。首先取hemoglobin ( pI~6.8 )及cytochrome c ( pI~10.7 )二種等比例的蛋白質標準品混合液,以10個區段的裝置做分離的測試,由實驗結果可以得到10段不同的收集液,其pH分佈的範圍為3到10,而在電泳槽中的ampholyte buffer也呈現不同顏色的區段,其中淡黃色為hemoglobin,暗紅色為cytochrome c,也都在各自的pI值範圍內,顯示有分離效果,同時證實本裝置可用於蛋白質的等電點聚焦電泳。
之後,再以蛋白質組成複雜的血清作為分析樣品,並將分離的區段增加到20及50個,來進行蛋白質的等電點聚焦電泳實驗。待分離完成後,再將每一個區段內所收集的溶液,以樣品用量少且具高分離效率的μ- HPLC/MS,對其中所含之蛋白質混合物再進行一次分離以及質譜鑑定。所得的結果利用程式的轉換,以灰階寬帶的方式來表示,其中黑色表訊號強度最高,而白色則表訊號最低,如此可方便來做圖譜的比對。
由於本技術樣品用量少,加上μ-HPLC/MS的分離和偵測效率佳,所以在此分析方法建立之後,對生物體中微量蛋白質的快速分析與鑑定將會有很大的幫助。
目錄
壹、緒論………………………………………………………1
一、前言……………………………………………………1
二、等電點聚焦電泳/液相層析的發展…………………...3
三、等電點聚焦電泳介紹…………………………………5
A .pH梯度………………………………………………7
B. 蛋白質表面的帶電形式……………………………11
C. IEF電泳原理………………………………………..13
四、高效能液相層析結合質譜儀(LC/MS)的發展………..15
伍、論文目標……………………………………………….20


貳、實驗…………………………………………….………..21
一、儀器裝置………………………………………………21.
A.等電點聚焦電泳部分………………………….……21
B.毛細管液相層析層析質譜法部分…………………..24
二、等電點聚焦電泳實驗組裝……………………………26
三、使用藥品及試劑………………………………………27
四、配製方法………………………………………………29
五、實驗流程………………………………………………30

參、結果與討論………………………………………………34
第一部份:……………………………………………………34
以10個區段之等電點聚焦裝置分離標準品蛋白質
第二部份:……………………………………………………39
以10個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質
第三部份:……………………………………………………45
以20個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質
第四部份:……………………………………………………54
以50個區段之等電點聚焦裝置分離血清蛋白質

第五部份:……………………………………………………62
再現性的探討
肆、結論………………………………………………………66

伍、參考文獻…………………………………………………68

陸、附錄
附錄一……………………………………………………71
附錄二……………………………………………………78
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