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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:林靜宜
研究生(外文):Samantha Ching-yi
論文名稱:荖濃溪流域之土壤微生物相調查
論文名稱(外文):Investigation of Soil Microbiota in the Lao-Nong River Basin
指導教授:劉仲康劉仲康引用關係
指導教授(外文):Jong-Kang Liu
學位類別:碩士
校院名稱:國立中山大學
系所名稱:生物科學系研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:91
中文關鍵詞:微生物多樣性纖維分解菌固氮菌溶磷菌荖濃溪
外文關鍵詞:nitrogen-fixing microbesphosphate-solubilizing microbesthe Lao-Nong Rivercellulytic microbesmicrobial biodiversity
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本研究針對高屏溪流域支流—荖濃溪流域氣候區之八個不同海拔樣區(100~2240公尺),於4/11/2003~3/21/2004期間,進行微生物多樣性調查,以探討不同地區及海拔高度樣區土壤微生物生態之異同與組成,以及微生物族群因季節不同而產生之變化。結果發現不同樣區之土樣特性各異:土壤溫度除天池較低 (7~19℃) 外,其餘樣區土溫介於24~32℃間;pH值介於4.00 (天池) ~8.20 (桃源);含水量介於2.31% (六龜) ~70.23% (天池);有機質含量方面,總有機碳介於0.38% (嶺口) ~36.21% (天池)、總有機氮介於0.067% (桃源) ~0.672% (天池)、碳氮比除天池平均約42外,其餘多介於7.0~25.0間。所有土壤樣品中,微生物組成方面以細菌含量最高,每克土壤約含有細菌106~108CFU,固氮菌105~107CFU,放線菌104~107CFU,真菌104~106CFU,纖維分解菌104~106CFU,溶磷菌最少,只有103~105 CFU。在分子生物菌相分析方面,DNA萃取方法以玻璃珠撞擊法獲得之細菌相較豐富。以PCR-DGGE圖譜分析比較各海拔代表樣區之四季細菌相,推論各區細菌相之季節性變化可能與梅雨、颱風等台灣特有氣候影響有關。此外,本研究亦針對研究調查期間所篩選出具特殊功能之菌種進行保存,目前已保存固氮菌65株、溶磷菌45株及纖維分解菌51株;這些長期保存之特殊功能菌種,可作為後續研究開發微生物資源篩選生物活性物等生技資源的種原。
To understand the soil microbial community structures of different locations and altitudes, as well as the fluctuation of microbial populations foward seasonal change, this study investigated the biodiversity of soil microbiota of eight sampling sites along the Lao-Nong River basin during 4/11/2003~3/21/2004. The results showed that the soil properties were different among these sampling sites. The soil temperatures were ranging in between 24~32℃, except Tianchr, the highest altitude sampling site (7~19℃) ; pH values were 4.00 (Tianchr) ~8.20 (Tauyuan) ; moisture contents were 2.31% (Liouguei) ~70.23% (Tianchr) ; total organic carbon contents were 0.38% (Linkou) ~36.21% (Tianchr) ; total organic nitrogen contents were 0.067% (Tauyuan) ~0.672% (Tianchr); the C/N ratio were 7.0~25.0, except Tianchr (42 in average) . In microbial community structures analysis, bacteria were the most abundant organisms among all soil samples (106~108 CFU per gram of soil) . The amount of other microbes were as follow: nitrogen-fixing microbes 105~107 CFU, actinomycetes 104~107 CFU, fungi 104~106 CFU, cellulolytic microbes 104~106 CFU, and the least one was phosphate-
solubilizing microbes 103~105 CFU. For molecular biological microbiota analysis, the bead-beating DNA extraction method resulted the richest bacterial 16S rDNA DGGE profile. The16S rDNA DGGE profiles of various samples taken from different seasons showed somewhat seasonal variations that might relate to the specific climates of Taiwan, such as the plum rains and typhoons. Moreover, we also successfully cultured and preserved many microbes with specific biological functions. These microorganisms will provide a useful resource for further research and development in the biotechnology industries.
目錄
謝誌…………………………………………………………………………………....I
中文摘要………………………………….………………………………...………..Ⅱ
Abstract……………………………………………………………………………...Ⅲ目錄……………………………………………………………………......................Ⅳ
表目錄……………………………………………………………………………......Ⅶ
圖目錄………………………………………………………………………………..Ⅷ一、緒論………………………………………………………………………………1
1.1 微生物多樣性研究之背景介紹及重要性………………………………….1
1.1.1 生物多樣性概述……………………………………………………..1
1.1.2 微生物多樣性研究的重要性………………………………………..2
1.1.3 土壤微生物之多樣性………………………………………………..3
1.1.4 土壤環境與微生物之關聯性………………………………………..6
1.2 土壤微生物多樣性研究上的困難、限制與展望…………………………..7
1.2.1 採樣方法的周全性…………………………………………………..7
1.2.2 傳統分離培養技術的瓶頸…………………………………………..8
1.3 16S rDNA在微生物鑑定、分類與多樣性研究上的優越性與應用……8
1.4 變性梯度電泳膠 (DGGE) 的應用………………………………………...9
1.5 研究目的…………………………………………………………………...10
二、材料與方法………………………………………………………………………12
2.1 研究樣區概述……………………………………………………………...12
2.1.1 玉山國家公園概述…………………………………………………12
2.1.2 荖濃溪流域概述……………………………………………………12
2.1.3 樣區採樣……………………………………………………………13
2.2 土壤環境因子分析………………………………………………………...15
2.2.1 土壤溫度的測定方法………………………………………………15
2.2.2 土壤pH值的測定方法…………………………………………….15
2.2.3 土壤含水量的測定方法……………………………………………15
2.2.4 土壤總有機碳的測定方法…………………………………………15
2.2.5 土壤總有機氮的測定方法…………………………………………16
2.2.6 土壤質地的測定方法………………………………………………17
2.3 菌種培養及分離純化:總生菌數及分離純化株...………………………18
2.3.1 細菌菌數測定………………………………………………………18
2.3.2 放線菌菌數測定……………………………………………………18
2.3.3 真菌菌數測定………………………………………………………18
2.3.4 固氮微生物菌數測定………………………………………………19
2.3.5 溶磷微生物菌數測定………………………………………………19
2.3.6 纖維分解微生物菌數測定…..……………………………………..19
2.3.7 針對特殊功能菌種建立長期保存的種原庫………………………20
2.4 以分生技術分析細菌相…………………………………………………...20
2.4.1 微生物群落之去氧核糖核酸萃取方法……………………………20
2.4.2 瓊脂膠體電泳………………………………………………………22
2.4.3 DNA再純化步驟…………………………………………………23
2.4.4 DNA濃度測定……………………………………………………23
2.4.5 進行PCR,放大16S rDNA……………………………………….24
2.4.6 以DGGE電泳分離PCR產物…………………………………….26
2.4.7 萃取緩衝液酸鹼值對DNA萃取效率之影響…...………………..27
三、結果與討論……………………………………………………………………..29
3.1 環境條件與土壤性質……………………………………………………...29
3.1.1 土壤粒徑分析及土壤分類…………………………………………29
3.1.2 氣溫與土溫…………………………………………………………29
3.1.3 土壤pH值………………………………………………………….30
3.1.4 土壤含水量…………………………………………………………31
3.1.5 土壤總有機碳含量…………………………………………………32
3.1.6 土壤總有機氮含量…………………………………………………33
3.1.7 土壤有機質和碳氮比………………………………………………33
3.1.8 海拔高度與環境條件和土壤性質之綜合討論……………………34
3.2 荖濃溪流域各樣區土壤微生物生態……………………………………...36
3.2.1 細菌含量……………………………………………………………36
3.2.2 放線菌含量…………………………………………………………36
3.2.3 真菌含量……………………………………………………………37
3.2.4 固氮菌含量…………………………………………………………38
3.2.5 溶磷菌含量…………………………………………………………40
3.2.6 纖維分解菌含量……………………………………………………41
3.2.7 海拔高度與微生物組成之綜合討論………………………………42
3.2.8 特殊功能菌種之保存………………………………………………44
3.3土壤細菌相之分生組成…………………………………………………….45
3.3.1 不同萃取方法之比較………………………………………………45
3.3.2 DNA濃度測定………………………………………………………46
3.3.3 去除土壤中抑制PCR之雜質………………………………………47
3.3.4 DGGE結果分析……………………………………………………..48
3.3.5萃取緩衝液的酸鹼值對DNA萃取效率之影響……………………48
3.4 綜合討論…………………………………………………………………...49
3.4.1 不同樣區在相同季節之比較………………………………………49
3.4.2 單一樣區在不同季節之比較………………………………………50
3.4.3 未來展望……………………………………………………………50
四、結論與建議……………………………………………………………………..52
五、參考資料………………………………………………………………………..75
六、附錄………………………………………………………..................................78































表目錄
表一、採樣區土壤質地分析…………………………………………………………54
表二、特殊功能菌種保存簡表……………………………………………………...54
表三、2003年9月份荖濃溪流域各樣區土壤樣品之相關背景資料……………..54
表四、冷解凍法之DNA濃度及純度測定…………………………………………55
表五、玻璃珠撞擊法之DNA濃度及純度測定…………………………………….55
表六、酵素法之DNA濃度及純度測定…………………………………………….55
表七、超音波震盪法之DNA濃度及純度測定…………………………………….56
表八、萃取緩衝液的酸鹼值對茂林土壤DNA濃度與純度之影響比較……..56
表九、萃取緩衝液的酸鹼值對桃源土壤DNA濃度與純度之影響比較……..56




























圖目錄
圖一、樣區概述………………………………………………………………………14
圖二、荖濃溪流域各樣區土壤pH值之季節性變化………………………………57
圖三、荖濃溪流域各樣區鄰近測站降水量之季節性變化…………………………57
圖四、荖濃溪流域各樣區土壤含水量之季節性變化………………………………58
圖五、荖濃溪流域各樣區土壤總有機碳含量之季節性變化………………………58
圖六、荖濃溪流域各樣區土壤總有機氮含量之季節性變化………………………59
圖七、荖濃溪流域各樣區土壤總凱氏氮(A)、氨氮(B)及總有機氮(C)含量之季節性變化…………………………………………………………………………..60
圖八、荖濃溪流域各樣區土壤碳氮比之季節性變化……………………………...61
圖九、荖濃溪流域各樣區土壤細菌含量之季節性變化……………………………61
圖十、荖濃溪流域各樣區土壤放線菌含量之季節性變化…………………………62
圖十一、荖濃溪流域各樣區土壤真菌含量之季節性變化…………………………62
圖十二、荖濃溪流域各樣區土壤固氮微生物含量之季節性變化…………………63
圖十三、荖濃溪流域各樣區土壤溶磷微生物含量之季節性變化…………………63
圖十四、荖濃溪流域各樣區土壤纖維分解微生物含量之季節性變化……………64
圖十五、荖濃溪流域各樣區總微生物含量之季節性變化…………………………64
圖十六、冷解凍法…………………………………………………………………65
圖十七、玻璃珠撞擊法……………………………………………………………65
圖十八、酵素法……………………………………………………………………66
圖十九、超音波震盪法……………………………………………………………66
圖二十、四種方法所得之DNA粗萃液濃度圖…………………………………….67
圖二十一、嶺口土樣及茂林土樣之DGGE圖譜……………………………….68
圖二十二、六龜土樣及寶來土樣之DGGE圖譜……………………………….69
圖二十三、桃源土樣及復興土樣之DGGE圖譜………………………………...70
圖二十四、梅山土樣及天池土樣之DGGE圖譜………………………………...71
圖二十五、萃取緩衝液的酸鹼值導致茂林土樣之核酸粗萃液的顏色差異....72
圖二十六、萃取緩衝液的酸鹼值導致桃源土樣之核酸粗萃液的顏色差異.....72
圖二十七、天池土樣、梅山土樣及茂林土樣於不同季節之DGGE圖譜………73
圖二十八、不同海拔高度代表樣區於不同季節下土壤DGGE細菌相比較圖……74
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