跳到主要內容

臺灣博碩士論文加值系統

(35.175.191.36) 您好!臺灣時間:2021/08/02 14:19
字體大小: 字級放大   字級縮小   預設字形  
回查詢結果 :::

詳目顯示

: 
twitterline
研究生:蘇志賢
研究生(外文):Chih-Hsien Su
論文名稱:外切核酸分解酶活性控制因子研究
論文名稱(外文):The Study of Control Factors of Exonuclease activities
指導教授:許志楧許志楧引用關係
指導教授(外文):Ian C.Hsu
學位類別:碩士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:原子科學系
學門:工程學門
學類:核子工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:74
中文關鍵詞:外切核酸分解酶單分子DNA定序
外文關鍵詞:exonucleasesingle molecule DNA sequencing
相關次數:
  • 被引用被引用:0
  • 點閱點閱:94
  • 評分評分:
  • 下載下載:8
  • 收藏至我的研究室書目清單書目收藏:0
單一分子生技研究的新領域近年來在國際間發展迅速,也為生物醫學提供了一個創新的舞台。而利用單分子的研究來發展DNA定序技術,預計將會是下一個具有很大潛力且可行的方法,它提供了一個作為基因體定序研究的利器。不過現行的技術研究仍有許多的問題及瓶頸亟待克服。本核心實驗室將以對DNA分子的操縱能力為基礎,配合已著手進行架設之光鑷子系統,在現今的國際研究中提供DNA CD-ROM定序的創新想法,並且初步進行利用酵素配合雷射光之激發控制研究,以期研發出具前瞻性的研究方法與成果。我們希望憑著巨觀的初步觀察,來作為接下來單分子微觀技術的基礎。
本論文主要架構可分成三部分:第一部份將對現行DNA定序技術做個概述與探討,並且整理出現行國際研究單分子定序所遭遇到的問題;第二部分則提出DNA CD-ROM 定序技術的初步構想與策略;最後則著重於實驗構想中,前段之“雷射光輔助外切核酸分解酶之控制”的研究。在研究中,初步完成了生物實驗流程的建立,並且著重於尋找出調控酵素活性的相關參數,以利後續研究之參考。結果顯示溫度因子在15℃~25℃之間,以每5℃切除速率增加一倍的關係影響酵素活性,並在37℃時達到最佳反應溫度;依實驗結果計算出ExoIII反應之活化能為19.1Kcal/mole;當利用添加NaCl來調控反應離子濃度時,酵素反應速率會隨NaCl濃度增加而線性的減少;當NaCl濃度接近270mM時,酵素的活性完全受到抑制反應速率接近0。至於實驗的再現性好壞尚無法評估,還需要有更多的重複實驗來增加統計量。
另外,針對cDNA微陣列晶片系統所研究的優化實驗,也整理於附錄4,內容主要為晶片雜合反應條件的優化研究。
Recently, the research of single molecule techniques has developed rapidly and now provides an innovative stage for bio-medical researches. Single molecule approach may provide a potential way and novel solution to developing DNA sequencing techniques that may probably be a powerful tool for genome research in the present day. However, at the present stage there still exist many obstacles that deserve to overcome. In this study, based on the capabilities of the DNA manipulation, together with the optical tweezers system, established in our core Lab, we will propose a new sequencing method with the help of exonuclease and laser excitation such that one can clip the single nuclide of a DNA and put them on the CD-ROM for ultra-fast and precision sequencing. Hope that this approach via macro and preliminary observation as a first step may be formed the basis of the following single molecule detection studies.
This thesis contains three major sections, the brief introduction of DNA sequencing and the list of the difficulties of the current single molecule technique, the fundamental idea and the preliminary strategy of DNA CD-ROM sequencing, and the study of “Laser Assisted Exonuclease Activities”, respectively. In this thesis, the key point is to find out the important related parameters in an effort to control the activity of exonuclease included the assist of laser. Finally, the results of the experiences concerning an “Optimization of DNA Hybridization Protocol for Microarray System” are clearly described in the appendix 4.
目錄
中文摘要…………………………………………………………………………I
英文摘要…………………………………………………………………………II
致謝………………………………………………………………………………III
目錄………………………………………………………………………………Ⅳ
圖目錄與表目錄…………………………………………………………………Ⅵ

第一章 緒論……………………………………………………………………1
1.1前言………………………………………………………………………1
1.2 DNA定序方法概述………………………………………………………3
1.3 單分子DNA定序原理與方法……………………………………………6
1.4 單分子DNA定序所遇到的問題…………………………………………10
第二章 CD-ROM DNA定序技術…………………………………………………12
2.1 DNA CD-ROM定序初步構想……………………………………………..12
2.2 DNA CD-ROM定序初步實驗程序………………………………………..13
第三章 雷射光輔助酵素之活性控制………………………………………….16
3.1 研究動機與目標………………………………………………………16
3.2 實驗理論與假設………………………………………………………16
3.2-1 酵素催化…………………………………………………………...16
3.2-2 酵素活性臨界點的控制……………………………………………21
3.2-2-1不同因子與酵素活性的研究設計…………………………22
3.2-3 酵素選擇標準………………………………………………………23
3.3 實驗方法及其步驟………………………………………………………25
3.3-1 光催化系統…………………………………………………………26
3.3-2 生物系統實驗………………………………………………………27
3.3-2-1起始物DNA的備製………………………………………….29
3.3-2-2外切核酸分解酶(ExoIII)的水解反應……………………..32
3.3-2-3 S1核酸分解酶消化(digest)單股DNA片段………………32
3.4 實驗結果與討論………………………………………………………….33
3.4-1雙股DNA與單股DNA的ethidium染色比較………………………33
3.4-2標準生物系統實驗流程之建立…………………………………..…34
3.4-3 ExoIII活性與溫度的關係…………………………………………38
3.4-4 反應活化能的評估………………………………………………….39
3.4-5 ExoIII活性與NaCl濃度的變化…………………………………..41
第四章結論與展望……………………………………………………………….43
參考文獻………………………………………………………………………….45
附錄一 ………………………………………………………………………..….47
附錄二 …………………………………………………………………………...52
附錄三 ……………………………………………………………………………54

圖表目錄
圖1-shotgun 基因體定序方法…………………………………………………4
圖2-微流體單分子DNA定序方法………………………………………………8
圖3-利用光纖尖端與螢光標第的DNA來進行單分子定序實驗………………9
圖4 -DNA CD-ROM定序初步構想圖…………………………………………….12
圖5-DNA CD-ROM定序初步構想流程………………………………………….13
圖6-外切核酸分解酶催化DNA的磷酸二酯鍵………………………………..18
圖7- DNA polymerase I 外切核酸分解活性機制………..…………………..18
圖8- Exonuclease III 外切核酸分解活性機制…….………………………….18
圖9-酵素催化反應使淨活化能降低…………………………………………...19
圖10-溫度與酵素活性的關係………………………………………………….21
圖11-酵素活性與pH值 的關係……………………………………………….21
圖12-鹽類濃度對蛋白質溶解度的影響……………………………………….21
圖13-被核酸分解酶水解過的基質DNA其片段分布………………………….24
圖14-ExoIII 所認基質DNA之特定端點結構………………………………….25
圖15-選用氙燈光源光譜……………………………………………………….26
圖16-光催化系統之光路設計…………………………………………………..27
圖17-建立標準生物系統實驗之流程圖………………………………………..28
圖18-puc19質體DNA電泳檢視…………………………………………………29
圖19-大腸桿菌puc19限制酶作用點資料……………………………………..30
圖20-大量限制酶切割結果電泳檢視…………………………………………..31
圖21-DNA膠純化電泳檢視…………………………………………………..31
圖22- Ethidium Bromide染色比較之實驗結果電泳圖……………….……..34
圖23-生物系統實驗流程之測試結果…………………………………………..36
圖24-ExoIII反應之電泳檢視……………………………………………….…..37
圖25-起始物DNA備製條件改變之比較電泳圖……………………………….37
圖26-不同溫度下ExoIII的反應活性電泳圖…………………………………...38
圖27-溫度與ExoIII反應速率關係圖…………………………………………...39
圖28-酵素反應活化能的評估…………………………………………………....40
圖29-不同NaCl離子濃度下酵素活性變化電泳圖……………………………..41
圖30-NaCl濃度與酵素反應速率關係圖………………………………………..42
表1-可見光譜及各光譜所具之光能…………………………………………….20
表2-現今文獻中單分子定序常用的外切核酸酵素整理……………………….23
表3-本節實驗劑量分配表………………………………………………………33
1. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 5463-7 (1977).
2. Watson, J. D. The human genome project: past, present, and future. Science 248, 44-9 (1990).
3. Adams, M. D. et al. A model for high-throughput automated DNA sequencing and analysis core facilities. Nature 368, 474-5 (1994).
4. Meldrum, D. Automation for genomics, part two: sequencers, microarrays, and future trends. Genome Res 10, 1288-303 (2000).
5. Weber, J. L. & Myers, E. W. Human whole-genome shotgun sequencing. Genome Res 7, 401-9 (1997).
6. Drmanac, R. et al. DNA sequence determination by hybridization: a strategy for efficient large-scale sequencing. Science 260, 1649-52 (1993).
7. Brenner, S. et al. Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays. Nat Biotechnol 18, 630-4 (2000).
8. Puapaiboon, U., Jai-nhuknan, J. & Cowan, J. A. Rapid and direct sequencing of double-stranded DNA using exonuclease III and MALDI-TOF MS. Anal Chem 72, 3338-41 (2000).
9. Marziali, A. & Akeson, M. New DNA sequencing methods. Annu Rev Biomed Eng 3, 195-223 (2001).
10. Eigen, M. & Rigler, R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5740-7 (1994).
11. Harding, J. D. & Keller, R. A. Single-molecule detection as an approach to rapid DNA sequencing. Trends Biotechnol 10, 55-7 (1992).
12. Stephan, J. et al. Towards a general procedure for sequencing single DNA molecules. J Biotechnol 86, 255-67 (2001).
13. Werner, J. H. et al. Progress towards single-molecule DNA sequencing: a one color demonstration. J Biotechnol 102, 1-14 (2003).
14. Klaus D L orrey, S. B., Michael Brinkmeiery, et al. Techniques for single molecule
sequencing. Bioimaging 5, 139-152 (1997).
15. Sauer, M. et al. Single molecule DNA sequencing in submicrometer channels: state of the art and future prospects. J Biotechnol 86, 181-201 (2001).
16. Foldes-Papp, Z. et al. Fluorescently labeled model DNA sequences for exonucleolytic sequencing. J Biotechnol 86, 203-24 (2001).
17. Seela, F. et al. Fluorescent DNA: the development of 7-deazapurine nucleoside triphosphates applicable for sequencing at the single molecule level. J Biotechnol 86, 269-79 (2001).
18. Dorre, K. et al. Highly efficient single molecule detection in microstructures. J Biotechnol 86, 225-36 (2001).
19. C, H., S. Monajembashi, K.O Greulich. Laser manipulation and UV induced single molecule reactions of individual DNA molecules. Journal of Biotechnology 52, 65-73 (1996).
20. Namasivayam, V., Larson, R. G., Burke, D. T. & Burns, M. A. Light-induced molecular cutting: localized reaction on a single DNA molecule. Anal Chem 75, 4188-94 (2003).
21. Bugg, T. An introduction to enzyme and coenzyme chemistry (1997).九州圖書文物有限公司
21. chin, J., F. Banaszczyk, V. Jubian, and X. Zou. Co(III) complex promoted hydrolysis of phosphate diesters: Comparison in reactivity of rigid cis-diaquotraazacobalt(III) complexes. J. Am. Chem.Soc. 111, 186-190 (1989).
22. Serpersu, E. H., Shortle, D. & Mildvan, A. S. Kinetic and magnetic resonance studies of active-site mutants of staphylococcal nuclease: factors contributing to catalysis. Biochemistry 26, 1289-300 (1987).
23. Hoheisel, J. D. On the activities of Escherichia coli exonuclease III. Anal Biochem 209, 238-46 (1993).
24. Palmer, T. Understanding Enzymes (1995).Fourth Edition.
25. Goodwin, P. M., Ambrose, W.P., Keller, R.A.,. Singlemolecule detection in liquids by laser-induced fluorescence. Acc. Chem. Res. 29, 607–613 (1996).
27. Fo¡Lldes-Papp, Z., Thyberg, P., Bjo¡L rling, S., Holmgren, A., & Rigler, R. Exonuclease degradation of DNA studied by fluorescence correlation spectroscopy. Nucleosides Nucleotides 16, 781–787 (1997).
28. Sauer, M., Angerer, B., Han, K.-T., Zander, C.,. Detection and identification of single dye labeled mononucleotide molecules released from an optical fiber in a microcapillary: First steps towards a new single molecule sequencing technique. Accepted by PCCP. (1999).
29 Brody, R. S., Doherty, K.G., Zimmerman, P.D.,. Processivity and kinetics of the reaction of exonuclease I from Escherichia coli with polydeoxyribonucleotides. J. Biol. Chem 261, 7136-7143 (1986).
30 Mitsis, P. G. & Kwagh, J. G. Characterization of the interaction of lambda exonuclease with the ends of DNA. Nucleic Acids Res 27, 3057-63 (1999).
31. information, m. p. p. SYBRR Green I Nucleic Acid Gel Stain. (2001).
32. information, m. p. p. SYBRR Green II RNA Gel Stain. (2001).
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
第一頁 上一頁 下一頁 最後一頁 top
無相關論文
 
1. 岳修平(1999):網路教學於學校教育之應用。課程與教學季刊, 2(4), 61-76.
2. 邱瓊慧(2001):中小學資訊科技融入教學之實踐。資訊與教育, 88, 3-9.
3. 何榮桂(2002a):台灣資訊教育的現況與發展--兼論資訊科技融入教學。資訊與教育,
4. 吳明隆(2002):WBI的教學原則及其在中小學的應用推展。視聽教育雙月刊, 44(1),
5. 王曉璿(1997):網路環境與教學應用。教師之友, 39(1), 7-13.
6. 徐西森(民85) 專科學校輔導工作現況調查與改進研究。輔導季刊,第32卷,第1期,第16-26頁。.
7. 王智玄(2000):新的學習策略-網路合作式學習之探討。資訊與教育, 78, 42-50.
8. 蕭文(民84) 從市場學角度談輔導工作的形成與發展;消費導向的輔導工作策略。輔導季刊,第31卷,第2期,第2-6頁。
9. 鄭文夫(民91) 我對目前輔導工作的法。諮商與輔導,第193期,第5頁。
10. 潘才學(民85)大學院校輔導工作之困境與突破,輔導季刊,第32卷,第1期,第2-9頁。
11. 曾端真(民85) 只有諮商是不夠的。諮商與輔導,第130期,第48頁。
12. 黃淑娟(民89) 我對學校輔導工作的看法。諮商與輔導,第175期,第10頁。
13. 郭國禎(民75) 我國大專生求助需欲與求助態度之調查研究。國立台灣教育學院輔導學報,第九期,第165-204頁。
14. 陳阿桂(民81) 當前學校輔導工作的問題,諮商與輔導,第73期,第16頁。
15. 陳雪珍(民88) 中學生對學校輔導工作的看法。諮商與輔導,第164期,第46-48頁。