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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:徐怡琳
研究生(外文):Yi-lin Hsu
論文名稱:利用矽烷類混合式自組裝單分子膜提高蛋白質晶片上抗體與檢體的接合效率
論文名稱(外文):The study of improving binding effeciency of antigen and antibody by using mixed silane-SAMs on the protein chips
指導教授:曾繁根曾繁根引用關係錢景常
指導教授(外文):Fan-Gang TsengChing-Chang Chieng
學位類別:碩士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:工程與系統科學系
學門:工程學門
學類:核子工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:101
中文關鍵詞:酵素連結免疫吸附分析法矽烷類混合式自組裝單分子膜抗原對抗體接合效率表面電漿共振
外文關鍵詞:ELISAMixed silane-SAMsThe binding effeciency of antigen and antibodySPR
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目前蛋白質晶片在傳統酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay,ELISA)檢測上所遇到的問題,除了蛋白質抗體固定於晶片上的效率外,因為抗體在同一種自組裝單分子層(Self-assembled monolayers,SAMs)的表面上固定(immobilize),因為緊密堆積而有立體空間障礙問題和方向性問題,導致和檢體抗原做反應時無法達到最有效的結合造成檢體的浪費。因此我們提出了利用不同功能、不同高度的矽烷類混合式自組裝單分子膜,分別是(3-Aminopropyl)trimethoxysilane(APTS)及Ethyltrimethoxysilane(C2)兩種官能基相似的化學分子,將抗體Goat anti-rabbit IgG豎立於晶片表面上的方法,藉由控制兩種SAMs分子的分佈比例與鍵結效率就可以提高抗體的自由度,而達到立體空間障礙的解決,使末端的抗原接合端(antigen binding site)得以大部分裸露出來,讓後續的抗原Rabbit anti-mouse IgG在和抗體接合時效率提高,以減少數量上的浪費。
由實驗結果得知,抗原對抗體的接合效率在APTS/C2體積混合比為1:10時可得到較佳(Optimal)的值,大約為0.3;相較於傳統單純APTS的表面效率為0.04;抗原對抗體的接合效率大致上提高了7.5倍左右,成功的達到本實驗設計的目的。
目 錄

第一章 前言 1
1.1 生物晶片 1
1.2 蛋白質晶片在檢測上的效率問題 8
1.3 有機單分子層的簡介 11
第二章 文獻回顧 16
2.1 自組裝單分子膜(SAMs)的成核過程與薄膜特性的探討 16
2.1.1 自組裝單分子膜(SAMs)之成膜種類 16
2.1.2 自組裝單分子膜(SAMs)之結構 16
2.1.3 矽烷類自組裝單分子膜之鍵結形式 18
2.1.4 矽烷分子與基材表面鍵結之反應機構 19
2.1.5 矽烷類自組裝單分子膜之成膜理論 22
2.1.6 影響矽烷類自組裝單分子膜反應之因素 23
2.2 表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance;SPR) 26
2.2.1 SPR共振原理 26
2.2.2 SPR感測分子間親和作用及動力參數估算 30
第三章 實驗設計 35
3.1 原理 35
3.2 實驗材料與藥品 39
3.2.1 SPR sensor chip: SIA Kit Au 39
3.2.2 ITO chip 39
3.2.3化學藥品 40
3.3 實驗方法與步驟 43
3.4 實驗分析儀器 47
3.4.1 AFM (Atomic Force Microscopy) 47
3.4.2 STM (Scanning Tunneling Microscopy) 52
3.4.3表面電漿子共振生物感測器 54
3.4.4 GenePix 4000B Microarray Scanner 59
第四章 結果與討論 61
4.1 Self-assembled monolayers成核過程 61
4.1.1 STM結果 61
4.1.2 In-situ AFM結果 71
4.2 Mixed Self-assembled monolayers 78
4.2.1 SPR實驗結果 78
第五章 結論 99
第六章 參考文獻 100

圖目錄
圖1.1 實驗室晶片之微氣相層析儀的示意圖………………………….2
圖1.2 聚合酵素鏈鎖反應晶片………………………………………….3
圖1.3 毛細管電泳晶片結構與操作示意圖…………………………….4圖1.4 基因晶片檢測原理……………………………………………….5圖1.5 蛋白質晶片檢測原理…………………………………………….6
圖1.6 傳統酵素連結免疫反應法(ELISA)示意圖…………………….10
圖1.7 利用矽烷類混合式自組裝單分子層作酵素連結免疫反應法(ELISA)示意圖…………………………………………………10
圖1.8 Langmuir-Blodgett薄膜製作程序………………………………12
圖1.9 分子吸附在基材表面的SAMs薄膜結構圖…………………...13
圖1.10 自動組裝薄膜製作流程……………………………………….14
圖2.1 自組裝界面活性劑之結構圖…………………………………...17
圖2.2 SAMs分子的鍵結方式………………………………………….18
圖2.3 OTS分子在玻璃表面之成膜機制………………………………20
圖2.4 OTS分子在含二氧化矽基材之成膜機構……………………....21
圖2.5 Kretschmann稜鏡組……………………………………………..27
圖2.6 反射係數與入射角之關係圖…………………………………...29
圖2.7 SPR 感測流程圖………………………………………………...31
圖2.8分析物通入前後的共振角改變量示意圖………………………32
圖2.9 親和作用之動力分析…………………………………………...32
圖3.1 長鏈ATPS分子和短鏈Ethyltrimethoxysilane(C2)分子混合與玻璃的鍵結示意圖……………………………………………….35
圖3.2 酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)過程的示意圖……………36
圖3.3 IgG分子結構圖…………………………………………………38
圖3.4 SAMs泡製方法…………………………………………………46
圖3.5 凡得瓦爾力與距離關係圖……………………………………...49
圖3.6 JPK公司原子力顯微鏡實體圖…………………………………50
圖3.7 在寬度為w,能量為V0的位能井上波函數示意圖…………..52
圖3.8 Biacore X實體圖………………………………………………...55
圖3.9 Biacore X系統工作原理………………………………………..56
圖3.10 雙連續流道設計示意圖……………………………………….57
圖3.11 Biacore公司之不同表面功能SPR晶片………………………58
圖3.12 SPR反應結果曲線……………………………………………..58
圖3.13 GenePix 4000B型螢光掃描器實體圖…………………………59
圖4.1 Hexyltrichlorosilane在(a)10秒(b)20秒(c)50秒(d)5分鐘,經平坦化之後的圖………………………………………………….62
圖4.1 Hexyltrichlorosilane在(e)10分鐘(f)30分鐘(g)1小時(h)2小時,經平坦化之後的圖(續)…………………………………………63
圖4.2 Hexyltrichlorosilane分子在(a)10秒(b)20秒(c)50秒(d)5分鐘(e)10分鐘(f)30分鐘(g)1小時(h)2小時,3D立體圖………………66
圖4.3 Hexyltrichlorosilane分子在(a)10秒(b)20秒(c)50秒(d)5分鐘(e)10分鐘的剖面圖(cross section)…………………………………...70
圖4.4 Octadecyltrichlorosilane(OTS)在In-situ AFM下成核(nucleation)過程的上視平面圖……………………………………………..75
圖4.5 Octadecyltrichlorosilane(OTS)在In-situ AFM下成核(nucleation)過程的3D立體圖………………………………………………77
圖4.6 APTS和C2混合式矽烷類分子高度差示意圖…………………78
圖4.7 ELISA過程的SPR標準反應圖…………………………………79
圖4.8 在APTS(0.2%)的表面上ELISA過程的即時反應圖………….80
圖4.9 在APTS/C2(1:3)的表面上ELISA過程的即時反應圖………..80
圖4.10 在APTS/C2(1:10)的表面上ELISA過程的即時反應圖…….81
圖4.11 在APTS/C2(1:30)的表面上ELISA過程的即時反應圖……..81
圖4.12 在APTS/C2(1:100)的表面上ELISA過程的即時反應圖…...82
圖4.13 在C2(0.2%)的表面上ELISA過程的即時反應圖…………....82
圖4.14 Goat anti-rabbit IgG抗體在不同體積濃度比的SAMs表面的鍵結或吸附量……………………………………………………84
圖4.15 IgG分子示意圖………………………………………………..85
圖4.16 微笑曲線說明示意圖………………………………………….85
圖4.17 Goat anti-rabbit IgG抗體在SAMs表面Kinetic分析曲線……86
圖4.18 Goat anti-rabbit IgG抗體在SAMs表面Kinetic分析曲線……86
圖4.19 Goat anti-rabbit IgG抗體在不同體積濃度的SAMs表面之親和力的數值……………………………………………………….88
圖4.20 Goat anti-rabbit IgG-Cy3在不同體積濃度SAMs的玻璃基材上的螢光反應圖…………………………………………………90
圖4.21 Goat anti-rabbit IgG-Cy3在不同體積濃度SAMs的玻璃基材上的螢光反應結果分析………………………………………….91
圖4.22 抗原對抗體的接合效率分析結果圖………………………….92
圖4.23 從APTS(1%)到ELISA過程的SPR即時反應圖…………….93
圖4.24 從APTS/C2(1:10)到ELISA過程的SPR即時反應圖……….94
圖4.25 從APTS/C2(1:30)到ELISA過程的SPR即時反應圖………..94
圖4.26 從APTS/C2(1:100)到ELISA過程的SPR即時反應圖………95
圖4.27 從C2(1%)到ELISA過程的SPR即時反應圖………………..95
圖4.28 Goat anti-rabbit IgG抗體在不同體積濃度比SAMs表面的鍵結或吸附量………………………………………………………97
圖4.29 抗原對抗體的接合效率分析結果圖…………………………97
表目錄
表3.1 銦錫氧化物薄膜特性…………………………………………...40
表3.2 NanoWizard ™ Atomic Force Microscope規格表………………51
表3.3 GenePix 4000B螢光掃描器性能規格表…………………….….60
表4.1 STM的參數設定………………………………………………...61
表4.2 AFM的參數設定………………………………………………...71
表4.3 不同體積濃度比SAMs表面在SPR實驗中的反應結果……..83
表4.4 Gene Pix 4000B Microarray Scanner的參數設定………………89
表4.5 從不同濃度體積的SAMs coating到ELISA過程的SPR即時反應結果…………………………………………………………..96
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