臺灣博碩士論文加值系統

近年來由於基因微陣列技術的進步，人類的基因密碼逐漸被專家所解密，然而真正影響細胞活動的是蛋白質，癌細胞所產生的蛋白質是癌症篩檢中重要的判讀依據，因此可供檢測蛋白質微陣列之製作益形重要。本論文利用生醫微機電製程技術，製作批次且廉價之蛋白質晶片，使用的檢體量少且可拋棄式的優點可避免檢體交互汙染，人性化操作介面可使蛋白質失去活性前能即時快速地轉印到檢測晶片表面。晶片以厚膜光阻SU-8作微流道，底部則以高分子軟性矽膠材料作為微印章，蛋白質檢體以滴管由儲存槽注入，經過微流道到達底部微印章陣列，以印章蓋印方式製作蛋白質微陣列，整個過程中利用毛細力驅動不需額外施力。本研究製作各式蛋白質微陣列，探討並歸類造成微陣列缺陷成因。目前已成功製作出三種不同形式蛋白質微陣列而不造成交互汙染，包括單種蛋白質陣列、多種蛋白質陣列及癌症檢體陣列。主要使用之蛋白質檢體為標定Cy3螢光的兔子免疫球蛋白抗體、標定Cy5螢光的老鼠免疫球蛋白抗體、子宮頸癌抗原E6及肝癌抗原HuRP。微陣列其尺寸標準差於3%以內，螢光強度在20%以內。利用晶片所製作出之癌症抗原微陣列，經由傳統酵素免疫螢光分析法，得到癌症檢測最小解析度約為1ng/μl。

The protein chip is a micro-chip with its surface modified to detect various disease causing proteins simultaneously in order to help find a cure for them. This thesis is going to introduce a back-filling protein chip without any external driving force. Bio-MEMS technique makes a batch of cheap chips, and they are disposable form samples cross contamination. The flow channels are made by SU-8；PDMS polymer was used for the array at the bottom. First of all, the protein samples were lead into the upper reservoirs by a pipette. Next the samples flowed through the micro-channels by the capillary force and arrived the array at the bottom. Finally different protein arrays would come out like the term of printing stamps. This research improves the quality of arrays and summarizes the problems of the faults of the arrays. The used protein solutions are Cy3-tagged anti-rabbit IgG and Cy5-tagged anti-mouse IgG. Now this chip can successfully demonstrate three types of arrays without cross-talk, including single-protein array, multi-protein arrays and cancer-marker arrays. Each spot is formed by a single droplet about 1nl at each position. These protein arrays is characterized with a deviation ±3% in size and 20% in fluorescent intensity. The cancer antigens were made by chip stamping and using ELISA (Enzyme Linked- Immuno -Sorbent Assay) method the cancer levels down to 1ng/μl were detected.

第一章 緒論 1
1-1 生物晶片概述 1
1-2 生物晶片的種類 5
第二章 文獻回顧 12
2-1 凝膠法 (So-Gel Method) 13
2-2 蘸水筆法 (Dip Pen Lithography) 15
2-3 雷射加工法 (Laser Direct Writing) 17
2-4 點針法 (Quill Pin Printing) 19
2-5 微壓印法 (Micro Contact Printing) 21
第三章 研究目的與實驗原理 24
3-1 新式蛋白質微陣列晶片系統 24
3-2 研究目的 28
3-3 實驗原理介紹 30
3-3-1 表面張力 30
3-3-2 酵素連結免疫吸附分析 (Enzyme Linked- Immuno -Sorbent Assay , ELISA) 34
3-3-3 螢光掃描器影像分析系統 38
第四章 蛋白質微陣列晶片製作與介面機構設計 40
4-1 蛋白質微陣列壓印晶片操作原理 40
4-2 蛋白質微陣列壓印晶片之製作 42
4-3 蛋白質微陣列檢測晶片之製作 47
4-4 新式蛋白質微陣列壓印台設計 49
4-5 新式輔助型壓克力設計 52
4-6 蛋白質微陣列晶片加厚設計 55
4-7 蛋白質微陣列晶片阻隔交互汙染設計 57
第五章 蛋白質檢測實驗結果與討論 59
5-1 高速攝影微壓印過程觀測 59
5-2 不同親水性之檢測晶片之高速攝影結果 62
5-3 不同檢測晶片之親水性對壓印大小之影響 68
5-5 蛋白質微陣列壓印實驗 70
5-5-1 單一種蛋白質壓印試驗 71
5-5-2 二種蛋白質壓印試驗 74
5-5-3 二種蛋白質及各二種不同濃度壓印試驗 76
5-5-4 應用癌症之蛋白質作ELISA檢測分析 77
第六章 螢光檢測結果與缺陷探討 81
6-1 微陣列壓印晶片檢測分析 81
6-2 影響微陣列印品質探討 89
6-2-1晶片製作中易造成缺陷之因素探討 90
6-2-2 生物處理方面中易造成缺陷之因素探討 99
6-2-3 機構設計方面易造成缺陷之因素探討 100
第七章 結論 101
參考文獻 102

圖目錄

圖1-1細胞微過濾用分離晶片 6
圖1-2 利用介電性質分離細胞之介電泳晶片 7
圖1-3 利用矽膠製作之PCR晶片 8
圖1-4 毛細管電泳晶片結構圖 9
圖1-5 DNA微陣列晶片示意圖 10
圖1-6 實驗室晶片之設計概念圖 11
圖2-1 運用凝膠法所製之蛋白質微陣列流程圖 14
圖2-2 不同酸鹼程度及基材對於凝膠圖形產生的影響 14
圖2-3 蘸水筆法之原理示意圖 15
圖2-4 蘸水筆法之操作原理示意圖 16
圖2-5 使用蘸水筆法製作之80nm寬ODT 16
圖2-5 使用蘸水筆法製作之數字圖案 16
圖2-6 雷射加工法原理示意圖 18
圖2-7 使用雷射加工法所製作之蛋白質陣列圖 18
圖2-8 點針設備示意圖 20
圖2-9 利用微機電技術製作之微型針頭 20
圖2-10 以微機電技術製作點針之點印結果 20
圖2-11 微印章法之製作過程圖 22
圖3-1 微縮型蛋白質陣列晶片系統 26
圖3-3 液珠表面張力之自由體圖 31
圖3-4 不同液體之表面張力所造成之毛細現象 32
圖3-5 固體液體及氣體三相表面張力示意圖 33
圖3-6 不同親水特性示意圖 33
圖3-7 一般ELISA示意圖 35
圖3-8 螢光掃描軟體背景值分析示意圖 39
圖4-1蛋白質陣列晶片壓印系統示意圖 41
圖4-2下層微印章頭製作流程圖 44
圖4-3 中層微流道及上層儲存槽製作流程圖 45
圖4-4 微流道電子顯微鏡照片 46
圖4-5 儲存槽及微流道電子顯微鏡照片 46
圖4-6 APTS{3-Aminopropyltrimethoxysilane}之化學式 48
圖4-7 BS3{Bis(sulfosuccinimidyl)suberate}之化學式 48
圖4-8 DSC(N,N’-Disuccinimidyl Carbonate) 之化學式 48
圖4-9 新式微壓印機台外觀立體圖 50
圖4-10 新設計之壓印機台立體圖 (a) 新式壓印晶片承接槽 (b) 新式固定機構 50
圖4-11 (a) 晶片與承接槽分解圖 51
圖4-11 (b) 晶片與承接槽組合圖 51
圖4-13(a) (b) 蛋白質微陣晶片與第三代壓克力分解示意圖 53
圖4-12 新式壓克力設計三維立體圖 54
圖4-14 蛋白質微陣列壓印晶片加厚示意圖 56
圖4-15 (a) 晶片加厚對準完成 (b) 晶片加厚對準失敗 之顯微鏡照片 56
圖4-16 膠帶與蛋白質微陣列晶片分解圖 58
圖5-1 壓印晶片流體觀測系統示意圖 59
圖5-2 觀測用機台之立體圖及放大圖 60
圖5-3 蛋白質微陣列壓印晶片壓印流程圖 61
圖5-4 晶片壓印於乾淨玻片上之分解圖 63
圖5-5晶片壓印於APTS-BS3玻片上之分解圖 64
圖5-6晶片壓印於APTS-DSC玻片上之分解圖 66
圖5-7晶片壓印於SU-8玻片上之分解圖 67
圖5-8 不同檢測晶片之親水角與壓印尺寸關係圖 69
圖5-10使用Anti-rabbit-IgG蓋印之結果 72
圖5-11使用Anti-mouse-IgG蓋印之結果 72
圖5-12 改良後Cy3及Cy5之蓋印結果 73
圖5-13 (a)為新式壓克力壓印結果(b)為膠帶阻絕後之壓印結果 75
圖5-14 連續壓印之結果與其放大圖 75
圖5-15 二種不同蛋白質及濃度壓印結果 76
圖5-16 E6與HuRP螢光掃描圖 79
圖5-17 不同濃度HuRP螢光掃描圖 79
圖6-1 七次連續蓋印及局部分大圖 92圖6-2 連續七次蓋印之微陣列平均尺寸分佈圖 83
圖6-3 連續七次蓋印之微陣列平均螢光強度分佈圖 83
圖6-4 連續七次蓋印之微陣列圖 84
圖6-5 Cy3濃度與螢光強度關係圖 86
圖6-6 Cy5濃度與螢光強度關係圖 86
圖6-7 Cy3濃度對數與螢光強度關係圖 87
圖6-8 Cy5濃度對數與螢光強度關係圖 87
圖6-9 不同亮度下四種不同濃度Cy5蓋印結果 88
圖6-10 影響微陣列晶片品質分析圖 89
圖6-11使用膠片光罩所定義之厚膜光阻SU-8微印章母模 91
圖6-12使用鉻光罩所定義之厚膜光阻SU-8微印章母模 91
圖6-13 PDMS未蝕刻完造成晶片阻塞示意圖 92
圖6-14 (a)為RIE未蝕刻完之照片 (b)為RIE已蝕刻完之照片 93
圖6-15 RIE高功率蝕刻過久造成鋁金屬產生皺褶圖 93
圖6-16 流道未顯影完全之顯微鏡照片 95
圖6-17 顯影完成時於不同景深之顯微鏡照片 95
圖6-18 (a) 晶片脫模前照片 (b) 晶片脫模後照片 97
圖6-19 微陣列晶片與一元硬幣比較圖 97

表目錄

表2-1 五種製作蛋白質晶片方式之比較表 23
表5-1 不同親水角檢測晶片與壓印尺寸表 69
表5-2 Cy3及Cy5之入射、激發光波長及顯色表 71
表6-1五乘五蛋白質微陣列之平均尺寸及螢光強度表 82

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