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研究生:羅靜琪
研究生(外文):Jing-Chi Ruo
論文名稱:流蘇幼花衍生胚性細胞懸浮培養及體胚發生誘導
論文名稱(外文):Young Floret-derived Embryogenic Cell Suspension Culture and Induction of Somatic Embryogenesis of Fringe Tree (Chionanthus retusus Lindl)
指導教授:許圳塗許圳塗引用關係
指導教授(外文):Chou-Tou Shii
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:園藝學研究所
學門:農業科學學門
學類:園藝學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:89
中文關鍵詞:植株再生流蘇體胚發生細胞懸浮培養
外文關鍵詞:plant regenerationCell Suspension CultureSomatic EmbryogenesisChionanthus retusus LindlFringe tree
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流蘇(Chionanthus retusus L.)之樹型與花型優美,為具有發展潛力之觀賞花木,同時也為具多種療效之藥用植物。由於種子具有上胚軸休眠之特性,且利用扦插繁殖時難發根,被列為難再生植物。本研究為利用流蘇之花器組織進行培養以及細胞懸浮培養,探討胚性細胞增生及體胚發生條件,期能量化形成體胚,以供微體繁殖之參考。
參試流蘇幼花序上約8-10 mm大小之小花作為培植體,接種於含生長素2,4-D組合細胞分裂素TDZ和BA之WPM培養基中。培養7天後即有少許癒合組織產生,而癒合組織多從花托基部切口處產生。比較生長素與細胞分裂素組合,其中以2,4-D 1.0~2.0 mg/L 組合BA 0.5 ~2.0 mg/L處理對癒合組織的誘導發生率較佳,均可達50﹪以上。癒合組織外觀為黃色或淺綠色,隨著培養時間增加,在表面會增生出淺黃色、團粒狀的癒合組織。
利用幼花衍生之癒合組織進行細胞懸浮培養。以WPM為基礎培養基、添加2,4-D 1.0 mg/L及蔗糖2﹪,或是MS培養基中修正硝銨氮鹽比為2:1、2,4-D 1.0 mg/L、蔗糖3 ﹪之環境。在培養八週後即有胞質緊密之細胞散出,待得到均質細胞系時,更換至以MS為基礎培養基、添加2,4-D 1.0 mg/L及蔗糖3﹪之增生培養基中,可得較高之細胞增生量。取30 ~ 60 mesh間之細胞團,平板培養於含NAA 0.2 mg/L、2ip 0.2 mg/L 、 kinetin 0.1 mg/L 及zeatin 0.05 mg/L之SH3培養基中,四週後可觀察到體胚形成。取大小約0.4 cm之子葉期體胚接種於含GA之發芽培養基中,四週後體胚之胚根及胚芽皆能順利萌發。
以流蘇未成熟有性胚所衍生之均質懸浮細胞系為供試材料,培養於MS培養基修正硝銨氮鹽比為2:1之環境下,細胞在繼代培養後第6天呈現快速增生之現象,第12天之後生長速度減緩。以此推測,以14天為一繼代間隔較為恰當,符合長期培養之增殖效率。而預處理之目的,在於能預極化生長,提升體胚形成品質。
一、 前言(Introduction)………………………………………………………………………1
二、 前人研究(Review)………………………………………………………………………………4
(一) 流蘇組織培養之發展概況………………………………………………………………4
1、胚芽胚根不同步休眠…………………………………………………………4
2、細胞懸浮培養再生………………………………………………………………………………4
3、芽體培養及幼花序培養體胚發生…………………………………………………5
(二) 體胚發生………………………………………………………………………………………………6
1、內生生長素含量……………………………………………………………………………………7
2、胚性潛力建立…………………………………………………………………………………………7
3、細胞分裂及分化…………………………………………………………………………8
4、胚性細胞之形態外觀……………………………………………………………………………8
5、酸鹼值的變化………………………………………………………………………9
(1)胞內酸鹼值的變化………………………………………………………………10
(2)胞外酸鹼值的變化………………………………………………………………10
(3)控制胞外酸鹼值策略………………………………………………………………11
6、極性建立………………………………………………………………………………………………12
三、材料與方法(Material and Methods)………………………………………13
(一) 幼花逆分化培養………………………………………………………………………13
1、材料消毒與處理………………………………………………………………………………13
2、胚性癒合組織之誘導………………………………………………………………………13
(二) 細胞懸浮培養系統之建立……………………………………………………………14
1、懸浮細胞系之建立…………………………………………………………………………14
(1)2,4-D濃度處理……………………………………………………………………14
(2)基本鹽類及蔗糖濃度處理………………………………………………………14
(3)修正氮源比例處理……………………………………………………………………14
2、培養環境與繼代時間………………………………………………………………15
3、流蘇懸浮細胞培養期間pH值之變化模式……………………………15
4、平板培養………………………………………………………………………………………………15
5、體胚發育及切片解剖之形態觀察…………………………………………………16
6、胚苗轉換…………………………………………………………………………………………17
(三) 預處理對胚性細胞生長形態之影響……………………………………………18
1、預處理對懸浮細胞生長形態之影響………………………………………18
(1)修正氮源比例處理……………………………………………………………………18
(2)培養基比較試驗……………………………………………………………………19
(3)培養液pH調控處理…………………………………………………………………19
2、胚性檢定………………………………………………………………………………………20
四、結果(Results)……………………………………………………………………………………21
(一) 幼花逆分化培養…………………………………………………………………………………21
(二) 懸浮細胞系之建立……………………………………………………………………22
1、2,4-D濃度處理…………………………………………………………22
2、基本鹽類及蔗糖濃度處理…………………………………………………………23
3、修正氮源比例處理……………………………………………………………………………24
4、胚性檢定……………………………………………………………………………………………25
(1)生長調節劑組合與體胚發育形態………………………………25
(2)體胚發育之解剖形態觀察…………………………………………26
(3)細胞團分級處理對體胚發生數量之影響………………27
(4) GA對體胚形態及發生數量之影響…………………………………………28
(5)培養介質對體胚形態及發生數量之影響………………………28
5、胚苗轉換………………………………………………………………………………………29
(三) 預處理對胚性細胞生長形態之影響……………………………………………30
1、修正氮源比例處理…………………………………………………………30
(1)對細胞生長形態之影響……………………………………………30
(2)胚性細胞生長速率比較……………………………………………31
(3)對pH胞外位階之影響……………………………………………31
2、培養基比較試驗……………………………………………………………………………31
(1)對細胞生長形態之影響……………………………………………31
(2)對pH胞外位階之影響………………………………………………32
3、培養液pH調控處理……………………………………………………………………33
4、胚性檢定……………………………………………………………………………………………34
(1)修正氮源比例處理…………………………………………………………………34
(2)培養基比較試驗……………………………………………………………………34
(3)培養液pH調控處理……………………………………………………………………35
五、討論(Discussion)……………………………………………………………………73
(一) 幼花逆分化培養…………………………………………………………………………73
(二) 懸浮細胞系之建立………………………………………………………………………74
(三) 體胚發生及胚苗轉換……………………………………………………………………76
(四) 預處理對胚性細胞生長形態之影響……………………………………………77
六、中文摘要(Abstract)…………………………………………………………………………79
七、英文摘要(Abstract)…………………………………………………………………………81
八、參考文獻(Reference)………………………………………………………………………83
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