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研究生:孫蕊美
論文名稱:土壤中多環芳香族碳氫化合物生物降解特性及菌群研究
指導教授:張碧芬張碧芬引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:東吳大學
系所名稱:微生物學系
學門:生命科學學門
學類:微生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2004
畢業學年度:92
語文別:中文
論文頁數:120
中文關鍵詞:多環芳香族碳氫化合物土壤堆肥降解
外文關鍵詞:PAHssoilcompostdegradation
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摘要
本研究探討各種添加物在土壤中對降解fluorene、phenanthrene、anthracene、pyrene等四種多環芳香族碳氫化合物PAHs的影響,並以PCR-DGGE觀察降解期間微生物相的變化。結果顯示在好氧下添加堆肥能顯著促進PAHs的降解,添加界面活性劑brij 30、酵母萃取物、EDTA也會促進PAHs的降解。其中以添加0.5 CMC的brij 30與0.1 mM的EDTA對PAHs從土壤中被移除有最佳效果。在單獨添加四種PAHs則會降低降解速率。以PCR-DGGE觀察降解期間微生物相的變化,發現不同添加物會使土壤中微生物相有不同變化,單獨添加四種PAHs的微生物相也和混合添加的有所不同。在分離出六株好氧純菌中,好氧菌S8是降解PAHs能力最佳的菌,經過定序比對出發現與Bordetella petrii相似度為98%,添加回土壤實驗發現會促進PAHs的降解速率,並且在PCR-DGGE的觀察中有發現其條帶存在。
在厭氧生物降解發現添加堆肥能促進PAHs的降解速率;另外添加EDTA、acetate、lactate與pyruvate也會促進PAHs的降解;添加界面活性劑brij 30對降解速率無影響;在不同厭氧狀態則發現脫氮狀態的降解速率最快;比較不同厭氧狀態與微生物抑制劑之實驗結果,初步推斷土壤中脫氮菌、甲烷生成菌與硫酸還原菌對PAHs的降解均有貢獻。PCR-DGGE的觀察則發現添加堆肥的菌相較為豐富明顯與未添加堆肥的土壤有所區別。不同厭氧狀態的微生物相則因馴化時間的不同而有所變化。在分離出四株厭氧純菌中,厭氧菌S35是降解能力最佳的菌,經過定序比對發現與Bacillus senegalensis相似度為82%,將其添加回土壤實驗結果發現沒有促進PAHs的降解,而從PCR-DGGE的觀察中發現S35的條帶隨著降解時間漸漸消失。
本研究在土壤中分離出好氧純菌六株厭氧與純菌四株,其中發現S8與S35分別是好氧與厭氧純菌中降解能力最好的菌株,而添加brij 30與EDTA會促進純菌降解PAHs的能力,純菌在土壤中降解的能力也比在培養基中還要好。本研究最適條件之探討可作為日後受到PAHs污染土壤之現地復育研究。
關鍵字:多環芳香族碳氫化合物,堆肥,土壤,降解。
Abstract
In this study, we investigated the effects of various factors on biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) such as fluorene, phenanthrene, anthracene and pyrene and characterized the structure of the microbial community in soil. Under the aerobic conditions, the results show that PAHs degradation rate significantly enhanced by the addition of compost. The addition of yeast extract, EDTA or surfactants such as brij 30 and triton N101 enhanced the PAHs degradation rate. The addition of individual PAHs decrease the PAHs degradation rate. The addition of different substrate would change the structure of the microbial community. We also isolated one bacteria which showed the greatest degradation potential were strain S8. PAHs degradation rate was enhanced by adding strain S8 into the soil. The results of PCR-DGGE show that strain S8 was exist in soil. Strain S8 was identified as Bordetella petrii.
Under anaerobic conditions, we found that the addition of compost, EDTA, acetate, lactate or pyruvate were enhanced the PAHs degradation rate. There were no significant differences when added brij 30. By comparing the results of the degradation rate under anaerobic conditions and microbial inhibiters, we found that denitrifying conditions had the higher degradation rates than other anaerobic conditions. The results of PCR-DGGE show that the biodegradation of soil and soil with composts were by different microbial groups. The structure of microbial communities in soil were different under different anaerobic conditions after adapted at six months. We also isolated one bacteria which showed the greatest degradation potential were strain S35. PAHs degradation rate was inhibited by adding strain S35 into the soil. The results of DGGE show that strain S35 was disappered in soil. Strain S35 was identified as Bacillus senegalensis. This results could offer the feasibility for removal of PAHs in soil environment by microbial biodegradation.
Key word:PAHs, soil, compost, degradation.
目 錄
中文摘要...............................................Ⅰ
英文摘要...............................................Ⅲ
目錄...................................................Ⅴ
表目錄.................................................Ⅵ
圖目錄.................................................Ⅷ
第一章 前言.............................................1
第一節 研究緣起......................................1
第二節 研究目的與內容................................6
第二章 材料與方法.......................................7
第一節 實驗材料......................................7
第二節 儀器設備.....................................10
第三節 實驗方法.....................................12
第四節 分析方法.....................................16
第五節 生物降解速率與化學動力學之計算...............22
第三章 結果............................................23
第一節 實驗品管.....................................23
第二節 不同土壤及堆肥降解PAHs結果...................24
第三節 批次降解實驗.................................25
第四節 純菌實驗.....................................28
第五節 變性梯度膠體電泳.............................34
第四章 討論............................................39
第五章 結論............................................46
參考文獻...............................................48
表目錄
表1-1、美國環保署調查土壤及堆肥中細菌與真菌的含量…………53
表2-1、堆肥性質………………………………………………………53
表2-2、土壤性質………………………………………………………53
表2-3、本實驗中所使用之引子名稱、序列與參考資料……………54
表2-4、DGGE實驗中膠體梯度之配置方法…………………………55
表3-1.1本研究PAHs於之滯留時間、回收率及儀器偵測極限。….55
表3-2.1、不同來源堆肥在不同溫度下對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。……………………………………………56
表3-2.2、不同來源土壤對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半
衰期(t1/2, day) 。……………………………………………………….56
表3-2.3、添加不同比例堆肥於土壤中對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………………..57
表3-3.1、不同添加物於土壤中對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) …………………………………………………57
表3-3.2、不同添加物於土壤中對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………………….……58
表3-3.3、添加三種微生物抑制劑於土壤中對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。………………………………………..58
表3-3.4、三種厭氧狀態對土壤降解四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………………………59
表3-4.1、好氧純菌性質………………………………………………60
表3-4.2、厭氧純菌性質………………………………………………60
表3-4.3、好氧純菌對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………………………………………61
表3-4.4、厭氧純菌對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………………………………………61
表3-4.5、菌種鑑定…………………………………………………….62
表3-4.6、同時添加不同好氧純菌對四種PAHs好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。………………………………………………….63
表3-4.7、在培養基中好氧純菌S8對不同添加物、單獨添加與高濃度PAHs之好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。………………63
表3-4.8、添加好氧純菌S8在土壤、堆肥或污泥中對不同添加物與單獨添加PAHs之好氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。……..64
表3-4.9、在培養基中添加EDTA與不同厭氧純菌對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。……………………………64
表3-4.10、厭氧純菌S35在土壤中與添加不同添加物對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………65
表3-4.11、在三種厭氧狀態添加厭氧純菌S35對四種PAHs厭氧降解常數(k, 1/day)與半衰期(t1/2, day) 。…………………………………65
圖目錄
圖1-1六種美國環保署列管之多環芳香族碳氫化合………………66
圖1-2、實驗架構。………………………………………………….67
圖3-1.1、(A)溶劑空白實驗之層析圖譜;(B)系統空白實驗之層析圖譜……………………………………………………………………68
圖3-1.2、(A)四種PAHs之層析圖譜;(B)標準品之檢量線。...69
圖3-2.1、不同來源堆肥對四種PAHs好氧降解之比較。…………70
圖3-2.2、不同來源土壤對四種PAHs好氧降解之比較。………….71
圖3-2.3、添加不同比例中興堆肥於土壤中對四種PAHs好氧降解之比較。……………………………………………………………………..72
圖3-3.1滅菌土壤控制組於好氧狀態下降解四種PAHs的降解圖。..73
圖3-3.2、添加不同堆肥及污泥於土壤中對四種PAHs好氧降解之比較。……………………………………………………………………..74
圖3-3.3、添加不同堆肥於土壤中降解期間之菌相及菌數變化。….75
圖3-3.4、不同濃度與單獨添加PAHs於土壤中好氧降解之比較。…76
圖3-3.5、不同添加物對於土壤中PAHs好氧降解之影響。………...77
圖3-3.6、添加堆肥於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。……..78
圖3-3.7、單獨添加四種PAHs於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。…………………………………………………………………….79
圖3-3.8、不同添加物於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。…..80
圖3-3.9、添加不同微生物抑制劑於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。…………………………………………………………………….81
圖3-3.10、不同厭氧狀態於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。..82
圖3-3.11、馴化不同厭氧狀態於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。………………………………………………………………………83
圖3-3.12、不同厭氧狀態培養時硫酸鹽、硝酸鹽、pH與ORP之變化。……………………………………………………………………..84
圖3-3.13、添加堆肥與不同厭氧狀態培養時產甲烷氣的變化。…85
圖3-4.1、從土壤中分離出具有降解PAHs好氧純菌的菌落外觀。…86
圖3-4.2、從土壤中分離出具有降解PAHs厭氧純菌的菌落外觀。…87
圖3-4.3、S1、S8、S33與SS35在電子顯微鏡下的照片。…………88
圖3-4.4、六株好氧純菌降解四種PAHs的比較。…………………...89
圖3-4.5、不同厭氧純菌對四種PAHs厭氧降解之比較。…………..90
圖3-4.6、具分解能力的好氧純菌與clone純菌的親源關係圖….….91
圖3-4.7、具分解能力的厭氧純菌與clone純菌的親源關係圖……..92
圖3-4.8、添加不同好氧純菌對四種PAHs好氧降解之比較。……..93
圖3-4.9、好氧S8菌降解不同濃度之PAHs的比較。………………94
圖3-4.10、在培養基中不同添加物對好氧S8菌降解四種PAHs的影響。…………………………………………………………………….95
圖3-4.11、混合添加四種PAHs與單獨添加對S8菌於土壤或培養基中好氧降解之比較。…………………………………………………….96
圖3-4.12、添加S8菌於已滅土壤、堆肥、污泥中對四種PAHs好氧降解的比較。………………………………………………………..97
圖3-4.13、添加S8菌於未滅土壤、堆肥、污泥中對四種PAHs好氧降解的比較。…………………………………………………………98
圖3-4.14、添加S8菌在不同添加物之土壤中對四種PAHs好氧降解的比較。………………………………………………………………99
圖3-4.15、在培養基中厭氧純菌對四種PAHs降解之比較。………100
圖3-4.16、添加厭氧純菌S35於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。
………………………………………………………………………...101
圖3-4.17、土壤中添加厭氧純菌S35對單獨添加四種PAHs厭氧降解之影響。………………………………………………………………..102
圖3-4.18、不同電子提供者對厭氧純菌S35於土壤中之PAHs厭氧降解的影響。……………………………………………..…………….103
圖3-4.19、在土壤中添加EDTA對厭氧純菌S35降解四種PAHs之影響。……………………………………………………………….…104
圖3-4.20、在土壤中添加厭氧純菌S35對降解不同濃度PAHs之影響。
………………………………………………………………………..105
圖3-4.21、在土壤中添加厭氧純菌S33、S35、S42、S43對降解四種PAHs之影響。…………………………………………………………106
圖3-4.22、不同厭氧狀態添加厭氧純菌S35於土壤中對四種PAHs厭氧降解之比較。………………………………………………………107
圖3-5.1、以垂直膠分析土壤中全DNA中的341至534片段所得變性梯度。………………………………………………………………...108
圖3-5.2、好氧純菌與clone所得純菌圖譜。…………………….109
圖3-5.3、好氧混合菌實驗原始堆肥與土壤與添加堆肥於土壤之菌相比較。…………………………………………………………………110
圖3-5.4、好氧混合菌實驗添加堆肥及單獨添加四種PAHs降解28天所得菌相。……………………………………………………………111
圖3-5.5、厭氧混合菌實驗添加堆肥及三種厭氧狀態下降解四種PAHs 49天後所得菌相。…………………………………………………..112
圖3-5.6、土壤中添加好氧純菌S8在不同處理下各時間點所得菌相。
………………………………………………………………………..113
圖3-5.7、土壤中添加厭氧純菌S35在不同處理下各時間點所得菌相。
………………………………………………………………………114
參考文獻
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