跳到主要內容

臺灣博碩士論文加值系統

(44.201.97.224) 您好!臺灣時間:2024/04/14 18:33
字體大小: 字級放大   字級縮小   預設字形  
回查詢結果 :::

詳目顯示

我願授權國圖
: 
twitterline
研究生:張嘉豪
論文名稱:Warfarin單鏈抗體之純化與特性描述
論文名稱(外文):Purificaiton and characterization of scFv against warfarin
指導教授:高振益高振益引用關係洪慧芝洪慧芝引用關係
學位類別:碩士
校院名稱:國立中興大學
系所名稱:生命科學系
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2005
畢業學年度:93
語文別:中文
中文關鍵詞:warfarinscFv
相關次數:
  • 被引用被引用:0
  • 點閱點閱:160
  • 評分評分:
  • 下載下載:0
  • 收藏至我的研究室書目清單書目收藏:0
Warfarin(3-(α-acetonylbenzyl)-4-hydroxycoumarin)是一種抗凝血劑藥物。其抗凝血機制是利用與vitamin K做競爭抑制,使體內vitamin K-dependent clotting factor的凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)效用大幅下降而影響凝血機制,在醫療上可防止血栓形成。然而Warfarin也有許多副作用,過量時會造成血尿、嚴重出血以及維生素K缺乏症。現今對於warfarin中毒的治療方法多以直接投以維生素K以中和毒性,但仍然不盡理想,因此若能製備出抗warfarin的單鏈抗體,將可運用在臨床治療上。
本實驗經由免疫小鼠、製作融合瘤等前人實驗,經由細胞培養採集單株抗體,並萃取其RNA,由已知重鏈與輕鏈的固定區域當引子作反轉錄,得到抗體中的重鏈與輕鏈基因片段,利用連接子(Gly4Ser)3
,分別將連接子接於重鏈的C端與輕鏈的N端,最後藉由SOE-PCR (splicing by overlap extension PCR)產生所要的單鏈抗體片段並放大之。爾後基因轉殖,利用E. coli作大量表現,並以親合性管柱及硫銨沈澱作初步純化。單鏈抗體之效價測定,利用競爭型ELISA方法試驗,以單鏈抗體與先前採集之warfarin單株抗體作競爭,結果顯示有抑制效果。進一步進行動物實驗,觀察此單鏈抗體在老鼠體內可有效的抑制warfarin所造成的毒性致死。

中文摘要 ………………………………………………………………. 5
前言 ……………………………………………………………………. 6
Warfarin用途 ………………………………………………………… 6
凝血機制及warfarin抗凝血機制 ……………………………………... 6
(1)Instrinsic pathway ……………………………………………... 7
(2)Extrinsic pathway ……………………………………………… 7
(3)Common final pathway ……………………………………….... 8
免疫抗原 …………………………………………………………..…9
單株抗體及融合瘤 …………………………………………………... 9
抗體分子的多樣性 …………………………………………………. 12
單鏈抗體 ……………………………………………………………13
實驗流程 ............................................................................................... 16
材料與方法 …………………………………………………………... 17
引子(Primer)................................................................................... 17
解凍細胞(cell thawing) ……………………………………………… 17
細胞繼代培養(cell passage) …..……………………………………… 18
細胞冷凍(cell freezing) ……………………………………………… 18
RNA extraction ……………………………………………………… 19
反轉錄反應(Reverse Transcription) …………………………………… 20
抗體重鏈及輕鏈PCR放大反應(PCR amplification of VH/VL) ………….. 21
連結子組裝反應(Assembly of scFv) ………………………………….. 22
最終組裝(Final assembly)…………………………………………. 23
E.coli質體之抽取(Extraction of plasmid)…………………………… 23
Agarose gel DNA electrophoresis ……………………………………... 24
DNA限制酶切割(Restriction Enzyme digestion of DNA)……………. 25
DNA的回收及純化(Gel extraction of DNA)……………………….. 26
scFv DNA與質體接合反應(Ligation of scFv DNA)………………… 26
熱休克勝任細胞之製備
(Preparation of competent cell, heat shock method)…………….……… 27
熱休克轉型作用(Heat Shock Transformation)…………………….… 28
單鏈抗體之表現 ………………………………………………….... 28
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) …. 29
蛋白質定量(Protein quantitation) ………………………………….….. 31
間接型酵素連結免疫測定法(Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Indirect ELISA) ………………………………………….………….. 31
單鏈抗體之酵素連結免疫測定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for scFv) ………………………………..……………..………………. 32
Ni-NTA親合力蛋白質純化
(Protein purification by Ni-NTA affinity column) …………………..…… 33
硫銨沈澱(Ammonium sulfate precipitation) ….………………………… 34
抗原合成(Production of antigen) …………..………………………….. 34
結果 …………………………………………………………………... 36
融合瘤之解凍與培養 ………………………………………………. 36
59D4單株抗體之效價測定 …………………………………………. 36
59D4 total RNA之抽取與反轉錄 ……………………………………. 36
單鏈抗體之放大 ……………………………………………………. 37
連接子接合反應 ……………………………………………………. 38
最終組裝 …………………………………………………………... 39
質體抽取及轉殖 ……………………………………………………. 40
大量表現單鏈抗體 …………………………………………………. 40
單鏈抗體蛋白質純化 ……………….………………………………. 42
BSA-Glu-warfarin抗原合成 …………………………………………. 43
59D4sc單鏈抗體ELISA效價測定 …………………………..………. 43
動物實驗 ………………………………………………………...… 45
討論 ……………………………………………………...…………… 45
結論 …………………………………………………………………... 49
附錄 …………………………………………………………………... 51
附錄一、本實驗引子序列 ………………………………………………... 51
附錄二、59D4sc DNA序列 ………………………………………………. 55
附錄三、Buffers for purification under native conditions …………………….. 56
附錄四、常用緩衝溶液與培養基 ………………………………………… 57
附錄五、重鏈及輕鏈之基因重組 ………………………………………… 59
附錄六、縮寫字對照表……………………………………………........... 61
參考文獻 …………………………………………………………...… 63

1. Balasubramanyam, M., M. J. Christopher, and K. R. Purushotham. 1984. J. Hyg. Lond. 93: 575-578
2. Brian Reavy, Angelika Ziegler, Julie Diplexcito, Sybil M. Macintosh, Lesley Torrance, and Mike Mayo. 2000. Protein Expression and Purification. 18: 221—228
3. Bird R. E., Hadman K. D., Jacobson J. W., Johnson S., Kaufman B. M., Lee S. M., Lee T., Pope S. H., Riordan G. S., Whitlow M. 1988. Science. 242: 423-426
4. Brooks D., and Zola H. 1982. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application, CRC Press. p. 1-58
5. D.M. Shaw , M.J. Embleton , C. Westwater, M.G. Ryan , K.A. Myers, S.M. Kingsman , M.W. Carroll , P.L. Stern. 2000. Biochimica et Biophysica Acta. 1524: 238-246
6. Dominique Eeckhout, EsbjoÈ rn Fiers, Rebecca Sienaert, Veerle Snoeck, Ann Depicker and Geert De Jaeger. 2000. Eur. J. Biochem. 267: 6775-6783
7. Ehrenforth S, Schenk JF, Scharrer I. 1999. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 25: 79-83
8. G.A. Bonwick, J.E. Cresswell , A.L. Tyreman, P.J. Baugh, J.H.H. Williams, C.J. Smith, R. Armitage, D.H. Davies. 1996. Journal of Immunological Methods. 196: 163-173
9. Goding J.W. 1980. J. Immunol. Method. 39: 258-308
10. Goding J. W. 1983. Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology. Academic Press.
11. Guangyu An, Ningzheng Dong, Bojing Shao, Mingqing Zhu, Changgeng Ruan. 2002. Thrombosis Research. 105: 331— 337
12. Haichao Wang, Ona Bloom, Minghuang Zhang, Jaideep M. Vishnubhakat, Michael Ombrellino, Jiantu Che, Asia Frazier, Huan Yang, Svetlana Ivanova, Lyudmila Borovikova, Kirk R. Manogue, Eugen Faist, Edward Abraham, Jan Andersson, Ulf Andersson, Patricia E. Molina, Naji N. Abumrad, Andrew Sama,1 Kevin J. Tracey. 1999. Science. 285: 256-260
13. Hunter, K. 1983. J. Chromatogr. 270: 267-276
14. Huston J. S., Levinson D., Mudgett-Hunter M., Tai M. S., Margolies M. N., Ridge R. J., Bruccoleri R. E., Haber E., Crea R., Oppermann H. 1988. Proc. Natl . Acad. Sci. USA. 85: 5879-5883
15. Joanne Brennan , Paul Dillon, Richard O’Kennedy. 2003. Journal of Chromatography B. 786: 327—342
16. Kitchen K., Lin G., Shelver W.L., Murtaugh M.P., Pentel P.R., Pond S.M.,
Oberst J.C., Humphrey J.E., Smith J.M., Flickinger M.C. 1995. J Pharm Sci. 84:1184- 1189
17. Lowenthal J., Birnbaum H.. 1969. Science. 164: 181-183
18. Mark S. Dennis, Min Zhang, Y. Gloria Meng, Miryam Kadkhodayan, Daniel Kirchhofer, Dan Combs, and Lisa A. Damico. 2002. The Journal of Biological Chemistry. 277: 35035—35043
19. Masanori Onda, Satoshi Nagata, Yasuo Tsutsumi, James J. Vincent, Qing-cheng Wang, Robert J. Kreitman, Byungkook Lee, and Ira Pastan1. 2001. Cancer Research. 61: 5070—5077
20. Nicole Reiche, Andreas Jung, Thomas Brabletz, Tanja Vater, Thomas Kirchner, and Gerhard Faller. 2002. Infection and Immunity. p. 4158—4164
21. Robert Schier, Jacqueline Bye, Gerald Apell, Adrian McCall, Gregory P. Adams, Magnus Malmqvist, Louis M. Weiner and James D. Marks. 1996. J. Mol. Biol. 255: 28—43
22. Rober G. B., James A. S., John T. M. 1972. Biochemistry. 11:1959-1961
23. S Sylvain Robin, Kliment Petrov, Thierry Dintinger, Anna Kujumdzieva, Charles Tellier, Michel Dion, 2003. Molecular Immunology. 39: 729—738
24. Stigbrand T., Ullen A., Sandstrom P., Mirzaie-Joniani H., Sundstrom B., Nilsson ., Arlestig L., Norrlund R. R., Ahlstrom K. R. and Hietala S.O. 1996. Acta Oncologic. 35: 259-265
25. Wen Yuan and Colin R. 2000. Parrishl Virology. 269: 471-480
26. Ylvain Robin, Kliment Petrov, Thierry Dintinger, Anna Kujumdzieva, Charles Tellier, Michel Dion. 2003. Molecular Immunology. 39: 729—738
27. Yasuko Shibata, Kimiyo Kurihara, Hisashi Takiguchi, And Yoshimitsu Abiko. 1998. Infection and Immunity. p. 2207—2212
28. Xiao K. Deng, Lance A. Nesbit, and K. John Morrow. 2003. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. p. 587—595
29. Zhong Zhang, Zhi-Hua Li, Fei Wang, Min Fang, Chang-Cheng Yin, Zhi-Yong Zhou, Qing Lin, and Hua-Liang Huang. 2002. Protein Expression and Purification. 26: 218—228

QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
第一頁 上一頁 下一頁 最後一頁 top
無相關論文
 
1. 22.詹慧珊、朱惠英、蔡宜萱與周利娜(2014),美髮服務業主管領導行為、工作特性與工作滿意之研究,美容科技學刊,第11卷第2期,頁5-29。
2. 8.林少龍、李文廷與陳曉天(2012),情緒表達性、情緒勞務與員工正面情感傳遞之關連性研究,中州管理與人文科學叢刊,第2卷第1期,頁1-21。
3. 17.許順旺、林笠倫與張姮燕(2010),國際線空服員對轉換型領導、服務氣候與服務導向公民行為之研究-以內、外控人格特質為干擾變項,人力資源管理學報,第10卷1期,頁53-77。
4. 16.張淑眧、陳志忠、李明興與蘇文娟(2006),組織結構、工作特性、員工生涯發展與組織承諾的關係探討,中華管理評論國際學報,第9卷第4期,頁1-27。
5. 13.林添鵬、廖珮妏、余鑑與于俊傑(2012),外籍勞工人格特質、工作特性與工作滿意度之研究-營造業為例,台灣勞動評論,第4卷第2期,頁221-250。
6. 26.鍾紹熙(2009),組織承諾和認知失調對管理會計與控制系統改變接受性之影響:內外控人格特質爲情境變數,美和技術學院學報,第28卷第1期,頁21-38。
7. 25.蔡惠丞、盧正宗、林麗霞與倪豐裕(2008),內外控人格特質對產品創新、管理會計資訊系統與組織績效間關係影響之探討,人文暨社會科學期刊,第4卷第2期,頁61-70。
8. 24.蔡明田、謝煒頻、李國瑋與許東讚(2008),創業精神與創業績效之關連性探討-創業動機、能力與人格特質的整合性觀點,創業管理研究,第3卷第3期,頁29-65。
9. 23.鄔佩君、陳彰儀與吳宗祐(2005),華人企業服務人員情緒勞動方式的前置因素與其結果之關係,教育與心理研究,第28卷第4期,頁693-719。
10. 21.黃敦群、紀乃文、張雅婷與郭洧岑(2014),情緒勞動的前因、後果與潛在干擾變數-統合分析法之探討,人力資源管理學報,第14卷第3期,頁93-134。
11. 11.林少龍、盧姍姍與陳曉天(2009),心理契約缺口與情緒耗竭之關係:情緒勞動之中介角色,運籌與管理學刊,第8卷第1期,頁1-15。
12. 9.林少龍、陳玟潔與陳曉天(2007),以情緒勞動為中介變數探討愉悅性與員工正面情感傳遞之關係,華人前瞻研究,第3卷第1期,頁95-113。
13. 7.李再長、李俊杰與曾雅芬(2005),大型企業組織生涯管理、個人生涯規劃、個人人格特質、工作滿意度之關連研究,人力資源管理學報,第5卷第1期,頁53-76。
14. 3.吳宗祐(2008),由不當督導到情緒耗竭:部屬正義知覺與情緒勞動的中介效果,中華心理學刊,第50卷第2期,頁201-221。
15. 2.余鑑、于俊傑與廖珮妏(2008),連鎖餐飲業員工人格特質、工作特性、工作滿意度之研究-以美式星期五餐廳為例,臺北科技大學學報,第41卷第2期,頁1-28。