由日本及台灣市售納豆產品中篩選出可生產高活性血纖維蛋白溶酶（納豆激酶）之菌株- Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2，藉由培養條件之探討以提高納豆激酶之產量。菌株在液態培養過程中，探討不同振盪條件、接種量、碳源、氮源、無機鹽類、pH及溫度等對菌株生產納豆激酶之影響，期望得到納豆菌生產納豆激酶之最佳培養條件。結果顯示，最適培養條件以150 rpm迴轉式振盪，250 mL Hinton’s 三角瓶中裝60mL培養液，接種量1% (v/v)，培養基組成份為2% glucose，1% soybean protein，0.5% soytone peptone及0.05% CaCl2，培養基之起始pH值為7.0，在37℃，150 rpm振盪下培養36小時，酵素活性為51.83±1 FU/mL。
利用5公升發酵槽探討納豆菌生產納豆激酶之擴大培養最佳生產條件。結果指出，接種1%種菌液，培養溫度37℃，通氣量1vvm，攪拌速率300 rpm，裝液量為2.5公升，B. subtilis var. natto NPUST B11-2培養36小時後可達到最佳酵素活性，其酵素活性為60.25 FU/mL，接種後6到24小時期間溶氧量趨近於零。
將大量生產所得之納豆激酶粗酵素液經超過濾濃縮(MWCO: 10 KDa)、硫酸銨30-70% (w/v)鹽析、CM-Sepharose CL-6B離子交換層析及Sephacryl S-200 HR膠體過濾層析等純化步驟，可純化出均一純度的納豆激酶，酵素比活性為600.1 FU/mg，純化倍率為6.21倍，回收率為2.4%；經由非還原性SDS-PAGE判定其分子量為30.4 kDa。
納豆激酶之生化特性探討，結果得知，酵素液之作用最適溫度及pH值，分別為60℃及pH 10.0，50℃作用1小時仍保有97.5%之活性，而於pH 5-11作用12小時仍保有88%以上之酵素活性。5 mM之Cu2+及Zn2+存在下對酵素活性有強烈抑制作用，其中以Cu2+為酵素之最強抑制劑; 而5 mM Ca2+、Mg2+、Ba2+、Na+及K+存在時，則對酵素活性具有提升的作用。納豆激酶除了可水解血纖維蛋白外，亦可水解血纖維蛋白酶原及血紅蛋白。在水解合成基質中以水解枯草菌素合成基質N-succinyl-Ala- Ala-Pro-Phe-ρNA之活性最強， NBSI、 PMSF 及DEPC幾乎完全抑制酵素活性，由以上結果可證實純化後酵素為類似枯草菌素之絲胺酸蛋白酶。

Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2 was isolated from Japan and Taiwan commercial natto products. B. subtilis var. natto NPUST B11-2 could produce high fibrinolytic enzyme activity (nattokinase) that degraded fibrin. The cultivation of B. subtilis var. natto NPUST B11-2 was investigated on the increasing nattokinase production. Shaking conditions, inoculums size, carbon sources, nitrogen sources, mineral salts, initial pH and culture temperatures were optimized for nattokinase production from B. subtilis var. natto NPUST B11-2. The results showed that 60 mL medium in 250 mL Hinton’s, which contained 2％ glucose, 0.5％ soytone peptone, 1％ soybean protein and 0.05％ CaCl2 and the medium initial pH 7, shaked with 150 rpm and 1% inoculums size producing the highest nattokinase activity (51.83±1 FU/mL) after cultured at 37℃ for 36 hours.
Five liter fermentor was used to evaluate the optimum scale-up cultivation conditions of B. subtilis var. natto NPUST B11-2 producing nattokinase. Inoculum size was 1%. The temperature, aeration rates, stirred speed and medium volume of fermentation were 37℃, 1 vvm, 300 rpm and 2.5 liter, respectively. The results indicated that B. subtilis var. natto NPUST B11-2 producing the highest nattokinase activity (60.25 FU/mL) after culture 36 hours. The DO value was nearly to 0 during fermentation time 6-24 hours.
In this study, the nattokinase has been purified successively almost homogeneous after 4 stages of purification (ultrafiltration, ammonium sulfate salting out (30-70%), CM-Sepharose CL-6B cation exchange and Sephacryl S-200 HR gel filtration chromatography). The specific activity of nattokimase was 600.01 FU/mL and purified yields 6.21-fold after these steps. The molecular weight of the enzyme was determined to be 30.4 kDa by SDS-PAGE.
The biochemical characteristics of nattokinase were studied. The optimum temperature and pH were 60℃ and pH 10.0, respectively. The stability of nattokinase after 1 hour keep at 50℃, the residual activity was 97.5%. The enzyme activities remained over 88% at pH 5-11 for 12 hours. The nattokinase activity was reduced drastically in the presence of 5 mM Cu2+ and Zn2+. Cu2+ was the strongest inhibitor. Whereas it was increase of nattokinase activity in the presence of 5 mM Ca2+、Mg2+、Ba2+、Na+and K+ .The enzyme also showed activity for hydrolysis fibrin, fibrinogen and hemoglobin. Among the synthetic substrates the most sensitive substrate was N-succinyl-Ala- Ala-Pro-Phe-ρNA for subtilisin. NBSI、PMSF and DEPC almost completely inhibited the activity of nattokinase. These results indicated that the purified enzyme is a subtilisin-like serine protease.

目 錄

頁次
中文摘要 I
英文摘要 III
誌謝 V
目錄 VI
圖表目錄 XI
壹、前言 1
貳、文獻回顧 3
一、 納豆的起源 3
二、 納豆菌 3
三、 納豆的神奇功效 4
(一) 納豆可預防骨質疏鬆症 4
(二) 納豆之異黃酮具有抗癌作用 6
(三) 納豆與抗氧化及抗老化 6
(四) 納豆可治療及預防心血管疾病、中風與癡呆症狀 7
(五) 納豆之降血壓作用 7
(六) 納豆對Escherichia coli O-157之抗菌效果 7
四、納豆激酶 (Nattokinase) 8
五、納豆激酶溶解血栓的功用 8
(一) 鏈激酶 11
(二) 尿激酶 11
(三) 組織性血纖維蛋白溶解酶激活素 13
六、 納豆激酶之特性 13
七、 由發酵食品中分離純化治療血栓的活性物質 15
八、 自然界動物中分離之血纖維蛋白酶 16
九、 血纖維蛋白酶之純化與特性 16
十、 田口方法 19
(一) 田口及RSM實驗設計差異 19
(二) 田口式品質工程介紹 19

(三) 品質特性的種類 20
(四) 雜音的觀念 21
(五) 信號雜訊比(S/N比) 21
(六) 直交表的應用 23
(七) 田口方法之參數設計 24
(八) 田口方法之流程 24
十一、田口實驗設計於食品上的應用 27
参、材料與方法 28
一、實驗材料 28
(一) 分離源 28
(二) 培養基 28
(三) 藥品 29
(四) 儀器設備 30
(五) 酵素純化材料及裝置 30
二、實驗流程 31
(一) 菌種之篩選 31
(二) 納豆菌生產納豆激酶最適培養條件探討 32
(三) 五公升發酵槽擴大培養條件探討 32
(四) 納豆激酶分離與純化 33
(五) 納豆激酶生化特性探討 33
三、實驗方法 34
(一) 菌種之篩選 34
1. 菌種之分離 34
2. 血纖維蛋白 (fibrin)之製造 34
3. 血纖維蛋白溶解酶活性之測定 34
4. 分解血纖維蛋白之菌株篩選 35
(二) 納豆菌生產納豆激酶最適培養條件測定 36
1. 生長曲線 36
2. 最適振盪培養條件之測定 36
3. 最適接種量之測定 36
4. 最適碳源種類之測定 36
5. 最適碳源濃度之測定 37
6. 最適氮源種類之測定 37
7. 田口試驗 37
8. 複合式氮源濃度之測定 38
9. 最適無機鹽類之測定 38
10. 最適無機鹽濃度之測定 38
11. 最適起始pH值之測定 41
12. 最適培養溫度之測定 41
13. 最適培養條件之生長曲線的測定 41
(三) 5公升發酵槽擴大培養條件探討 41
1. 最適攪拌速率之測定 41
2. 最適接種量之測定 44
3. 最適通氣量之測定 44
4. 添加消泡劑試驗 44
5. pH值控制試驗 44
(四) 納豆激酶之純化 45
1. 粗酵素液之製備 45
2. 超過濾濃縮 45
3. 硫酸銨鹽析及透析 45
4. 陽離子交換管柱層析 45
5. Sephacryl S-200 HR膠體過濾層析 46
(五) 納豆激酶之生化特性探討 46
1. 分子量測定 46
(1) Sephacryl S-200 HR膠體過濾層析法 46
(2) SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳法(SDS-PAGE) 46
(3) 染色法 47
2. 最適作用溫度測定 47
3. 熱穩定性測定 48
4. 酵素最適作用pH值測定 48
5. 酵素pH穩定性測定 48
6. 金屬離子對納豆激酶活性之影響 48
7. 納豆激酶對不同蛋白質水解能力之探討 49
8. 納豆激酶對化學合成基質之水解能力 49
9. 化學試劑對酵素活性之影響 49
肆、結果與討論 50
一、菌種之分離與篩選 50
二、菌株鑑定 50
三、納豆菌生產納豆激酶最適培養條件探討 55
(一) 生長曲線 55
(二) 最適振盪培養條件之測定 55
(三) 最適接種量之測定 58
(四) 最適碳源種類之測定 58
(五) 最適碳源濃度之測定 61
(六) 最適氮源種類之測定 61
(七) 田口設計試驗 61
(八) 複合式氮源濃度之測定 69
(九) 最適無機鹽類之測定 74
(十) 最適無機鹽類濃度之測定 74
(十一) 最適起始pH值之測定 77
(十二) 最適培養溫度之測定 77
(十三) 最適培養條件之生長曲線的測定 77
四、五公升發酵槽擴大培養條件探討 80
(一) 最適攪拌速率之測定 80
(二) 最適接種量之測定 82
(三) 最適通氣量之測定 82
(四) 添加消泡劑試驗 85
(五) pH值控制試驗 85
(六) DO值測定 87
五、納豆激酶的酵素純化 87
(一) 純化步驟的選定 87
(二) 硫酸銨鹽析 91
(三) 離子交換層析 91
(四) 膠過濾層析 93
(五) 純化總表 93
六、納豆激酶之生化特性 97
(一) 分子量 97
(二) 最適作用溫度測定 99
(三) 熱穩定性測定 99
(四) 最適作用pH值測定 99
(五) pH穩定性 103
(六) 金屬離子對納豆激酶活性之影響 103
(七) 納豆激酶對不同蛋白質水解能力之探討 106
(八) 納豆激酶對化學合成基質之水解能
力受質特異性 106
(九) 化學修飾試劑對酵素活性之影響 110
伍、結論 113
參考文獻 115
作者介紹 125

圖目錄

圖1、 納豆激酶之胺基酸序列 9
圖2、 納豆激酶之活性部位 10
圖3、 血液凝結機制 12
圖4、 納豆激酶在血栓溶解系統中之直接與間接作用 14
圖5、 田口試驗之實驗設計流程 26
圖6、 血纖維溶解酵素在血纖維蛋白平板
作用後產生之透明圈 53
圖7、 Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2
菌株的顯微鏡照相 54
圖8、 Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2於培養基中其
納豆激酶活性、pH及總生菌數的變化情形 56
圖9、 迴轉式及往復式振盪培養對Bacillus subtilis var.
natto NPUST B11-2生產納豆激酶之影響 57
圖10、 接種量對Bacillus subtilis var. natto NPUST
B11-2生產納豆激酶的影響 59
圖11、 各種碳源對Bacillus subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 60
圖12、 不同葡萄糖濃度對B. subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 62
圖13、 不同氮源對B. subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 63
圖14、 因子之S/N比的反應圖 67
圖15、 因子之S/N比的反應圖 72
圖16、 各種無機鹽類對Bacillus subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 75
圖17、 不同CaCl2濃度對Bacillus subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 76
圖18、 不同起始pH值對Bacillus subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 78

圖19、 不同培養溫度對Bacillus subtilis var. natto
NPUST B11-2生產納豆激酶的影響 79
圖20、 B. subtilis var. natto NPUST B11-2於最適培養基中其
納豆激酶活性、pH及總生菌數的變化情形 81
圖21、 不同攪拌速度對菌株生產納豆激酶的影響 83
圖22、 不同接種量對菌株生產納豆激酶的影響 84
圖23、 不同通氣量對菌株生產納豆激酶的影響 86
圖24、 不同消泡劑添加量對菌株生產
納豆激酶的影響 88
圖25、 pH控制對菌株生產納豆激酶的影響 89
圖26、 納豆菌生產納豆激酶及D.O.之變化情形 90
圖27、 納豆激酶培養液進行不同硫酸銨
濃度劃分結果 92
圖28、 經30-70%飽和度硫酸銨沉澱回收之納豆激酶
之CM-Sepharose CL-6B離子交換層析圖 94
圖29、 Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2產生
之納豆激酶之Sephacryl S-200 HR層析圖 95
圖30、 利用SDS-PAGE電泳分析不同純化
階段之納豆激酶 96
圖31、 Sephacryl-200 HR膠過濾層析法製作
蛋白質分子量標準曲線 100
圖32、 以SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳圖測定
納豆激酶之分子量 101
圖33、 納豆激酶之最適作用溫度 102
圖34、 納豆激酶之熱穩定性 104
圖35、 納豆激酶最適作用pH 105
圖36、 納豆激酶之熱穩定性 107

表目錄

表1、 主要的納豆菌株 5
表2、 數種Bacillus 屬所產生的胞外蛋白酶 18
表3、 四因子三階次水準直交表 25
表4、 各因子碳源、氮源、無機鹽及pH濃度之設計 39
表5、 各因子碳源、氮源、無機鹽類及pH其試驗濃度組合表 40
表6、 各氮源及無機鹽類試驗濃度之設計 42
表7、 各因子soytone peptone、soybean protein 、
interactions 和KCl之試 驗濃度組合表 43
表8、 不同B. subtilis菌株生產納豆激酶之活性 51
表9、 納豆激酶在血纖維蛋白平板中作用後之透明圈大小 52
表10、 實驗數據及各組實驗的S/N比 65
表11、 因子之S/N比的反應表 66
表12、 變異數分析表 68
表13、 實驗數據及各組實驗的S/N比 70
表14、 因子之S/N比的反應表 71
表15、 變異數分析表 73
表16、 Bacillus subtilis var. natto NPUST B11-2所生產
Nattokinase之純化總表 98
表17、 不同金屬離子對納豆激酶活性之影響 108
表18、 納豆激酶水解各種蛋白質之相對活性 109
表19、 納豆激酶水解各化學合成基質相對活性比較 111
表20、 各種化學修試劑對納豆激酶活性之影響 112

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