臺灣博碩士論文加值系統

本研究將所收集所得之Antrodia屬14個種17株菌進行ITS1-5.8S-ITS2、18S rDNA之部分序列定序，並由NCBI GeneBank資料庫截取與Antrodia屬相關之另外8個屬15種共32個菌株，進行18S rDNA之部分序列進行類緣分析。此外，也由NICI GeneBank資料庫截取Antrodia及相關屬種共9屬23種47個菌株之28S rDNA之部分序列，共同進行親緣探討；並利用MEGA 3軟體配合neighbor-joining法建構類緣樹。應用18S或28S rDNA部分序列所建構之類緣樹顯示，Antrodia之屬所涵蓋之14個種，皆會形成一群（clade），因此無法支持需將A. cinnamomea及A. salmonea由Antroida屬分離，而單獨設為Taiwanofungus此一新屬之兩個新組合種（combination nova）之假設。但在結果中亦發現部分多孔菌科之菌種與Antrodia在類緣演化樹上之關係較為接近，因此Antrodia被設立於Meripilaceae科的分類地位上是否適確，似有進一步探討的必要。應用HPLC分析Antrodia菌種之甲醇粗萃物之圖譜顯示，似無法與rDNA推演所得之類緣演化樹有一演化之相關性，但在其retention time約28.5分鐘時，Antrodia菌種皆有一連續5-7個類似三萜類化合物波峰產生，此圖形似可作為辨識Antrodia之化學指標。以16種Antrodia之甲醇萃取物對人類肝癌細胞株Hep G2、人類肺癌細胞株A549與小鼠纖維母細胞株NIH-3T3進行其生理活性之檢測，結果顯示Antrodia屬中11種菌種對Hep G2有50％以上之生長抑制率，而有7種則對A549有高於50％以上之生長抑制率，但所有之測試之16種Antrodia則對NIH-3T3無明顯之抑制率。此外，在檢測Antrodia之菌種，顯示A. sinuosa對於兩癌細胞株之抑制作用與A. cinnamomea之抑制效果相似，但生長較A. cinnamomea迅速，培養7天後，每克乾菌絲即可萃取得甲醇粗抽物113.52 mg，故似具研發應用潛能。而牛樟芝抗發炎反應之研究中，牛樟芝乙酸乙酯層對於經LPS誘導（lipopolysaccharide）小鼠巨噬細胞株（RAW 264.7）所產生之NO（nitric oxide），在50 μg/ml劑量時，仍具有60％以上對NO的明顯抑制作用。更進一步對A. cinnamomea菌種進行生理活性檢測，顯示其乙酸乙酯層之抑制癌細胞株效果比甲醇抽提層更佳。故未來應針對乙酸乙酯層單一活性成分進行分離、純化，並鑑定其有效生理活性成分之化合物種類及界定其特性。

o define the phylogenetic relationship of Antrodia and allied genera, the ITS1-5.8S-ITS2 rDNA or partial 18S and 28S rDNA sequences, which were either generated by our laboratory or retrieved from NCBI GeneBank database, were analyzed by MEGA 3 in combination with neighbor-joining algorithium. The constructed phylogenetic trees by 18S or 28S rDNA sequences showed that all the 14 Antrodia species were clustered in a monophyletic clade. The results did not endorse the recombination of A. cinnamonmea and A. salmonea to a newly erected Taiwanofungus genus. The phylogenetic analysis also indicated a more close relationship of Antrodia to Polyporaceae rather than Meripilaceae. Evidence also revealed that the HPLC chromatogram of mycelia methanol extract from Antrodia did not congruent with rDNA phylogenetic clade, though some of the unique peaks in the chromatograms may possibly serve as the markers of the 14 Antrodia species. Of the 16 Antrodia species tested, the methanolic extract of 11 species exhibited more than 50％ suppression activity toward Hep G2, while 7 species showed more than 50％ suppress effect toward A549. Nevertheless, all the Antrodia strains tested none of them exhibited marked suppression effect towarded the normal cell line NIH-3T3. Furthermore, the ethyl acetate fraction from A. cinnamomea mycelia also suppress the inflammatory response of mouse macrophage cell line（Raw 264.7） induced by lipopolysaccharide（LPS） at dosage of 500 ng/ml. In general, A. cinnamomea the mycelia ethyl acetate fractions were more potent than methanol fraction on their cancer cell suppress activity. Consequently, the active constituents in these fractions deserve to further purification and characterization.

目錄

中文摘要……………………………………………………………………….i
英文摘要……………………………………………………….………….….iii

壹、前言………………….…………………………………………..………..1

貳、前人研究
1. 樟芝………………………………………………….……….…..………....2
1-1. 樟芝的發現………………………...…………......………….…..……….2
1-2. 樟芝構造…………………………………..………………….….……….2
1-3. 樟芝成份簡介……...………………………………………..……………3
1-4. 樟芝有效成分分析………………………………………....................….3
1-5. 樟芝成分化合物….………..…………………..……………...………….6
1-6. 樟芝類緣分析相關論文…………….………………………………..….6
2. 樟芝分類概敘…………………………………………………………..…..7
2-1. 薄孔菌屬（Antrodia genus）在真菌分類上之地位….…….……..…….7
2-2. 薄孔菌屬（Antrodia genus）在種內之分類…….……………..…….…10
2-3. 傳統鑑定方法…………….……..……………..…………...……..…….12
2-4. 分子鑑定系統…………………..……..…………………………..…….13
2-5. 類緣學簡介…………………..……..…………………………..……….13

参、材料與方法
一、Antrodia屬成員之類緣分析.……………………………………..…….15
1. 樟芝菌絲體及薄孔菌屬（Antrodia）成員的來源與培養……………….15
2. 菌體DNA之萃取…………………………………………….………..….17
3. 聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction）………….……………...18
4. PCR產物與膠體DNA純化…………………………………….…..…..20
5. T-A cloning之進行……………………………………………..…….….21
6. 核酸序列分析（DNA sequence analysis）………………..……..………21
二、Antrodia屬菌絲體萃取物之生理活性檢測…………………………….22
1. Antrodia屬成員之菌株菌絲體甲醇萃取……………………………..…...22
2. 樟芝菌絲體萃取與分離……………………………………………….....23
3. Antrodia屬菌絲體甲醇萃取液高效液相層析分析…………..…….….…24
4. 細胞活性測試……………………………………………………………..24
5. 抗發炎測試……………………………………………………………......29

肆、結果與討論
一、Antrodia屬成員之類緣分析…………………………………………….30
1. Antrodia屬成員之培養…………………………….………..…………..30
2. 28S rDNA序列分析……………………………………………..………31
3. 18S rDNA序列分析…………………………………………..…………32
4. ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列分析…………………………….………….33
5. 次級代謝物HPLC圖譜…………………………………….…………….34
二、Antrodia菌種菌絲體萃取物之生理活性檢測……………….………...35
1. Antrodia菌種菌絲體甲醇萃取………………………………….………35
2. 樟芝菌絲體萃取及乙酸乙酯分離部份………………………….……….35
3. Antrodia菌種甲醇萃取物細胞毒性檢測…………………….……………36
4. 樟芝乙酸乙酯層分液細胞毒性檢測……………………………………..37
5. 樟芝乙酸乙酯層分液抗發炎反應檢測…………………………………..38
伍、結論與未來展望………………………………………………………..39

陸、Referance………………………………………………………………...40

柒、表………………………………………………………………………….46

捌、圖………………………………………………………………………….56

玖、附錄………………………………………………………………………87

表目錄

表一、本次研究所使用之Antrodia屬42種菌株之學名、來源與編號……47
表二、Antrodia 屬不同種於MEA培養至菌落直徑八公分所需天數……49
表三、28S rDNA sequences of Antrodia and related genera retrieved from National Center of Bioinformatics Institute（NCBI） GeneBank for
phylogenetic analysis using MEGA 3………………………………..50
表四、18S rDNA sequence of Antrodia and related genera retrieved from
National Center of Bioinformatics Institute（NCBI） GeneBank and the
Applied Mycology Laboratory（NTU） for phylogenetic analysis using MEGA 3…………….……………………………………………........52
表五、Sequences of ITS1-5.8S-ITS2 rDNA from Antrodia collected by Applied
Mycology Laboratory（NTU） for phylogenetic analysis using MEGA 3…………………………………………………………………….… 54
表六、不同Antrodia菌種液態發酵每克乾菌絲經甲醇萃取所回收得之甲醇
抽提物含量（mg）……………………………………………………55


圖目錄

圖一、自樟芝子實體所分離得之樟芝菌落…………………………………57
圖二、Antrodia屬不同菌種菌落形態（I）………...........…………………58
圖三、Antrodia屬不同菌種菌落形態（II）……………………………………59
圖四、由NCBI GeneBank收集獲得之不同菌種28S rDNA部分序列。經
MEGA3軟體及neighbor-joining分析法所建構之類緣樹圖………60
圖五、Antrodia 菌種 18S rDNA以NS5與NS6 primers增幅出之PCR 產
物電泳………………………………………………………………..61
圖六、Antrodia 屬內14種菌種以引子NS5與NS6增幅出310 bp大小之
18S rDNA序列排序結果……………………………………………62
圖七、由NCBI GeneBank收集獲得之18S rDNA序列及Antrodia不同菌種
獲得之18S rDNA部分序列。經MEGA3軟體及neighbor-joining分
析法所建構之類緣樹………………………………………………..64
圖八、Antrodia菌種以引子ITS4與ITS5增幅出之ITS1-5.8S-ITS2 rDNA
PCR產物電泳………………………………………………………..65
圖九、Antrodia 屬內14種菌種以引子ITS4與ITS5增幅出之ITS1 rDNA
序列排序結果…………………………………………………………66
圖十、Antrodia 屬內14種菌種以引子ITS4與ITS5增幅出之5.8S rDNA
序列排序結果......................................................................................69
圖十一、Antrodia 屬內14種菌種以引子ITS4與ITS5增幅出之ITS2 rDNA
序列排序結果......................................................................................71
圖十二、Antrodia 不同菌種以ITS4與ITS5增幅出之ITS1-5.8S -ITS2 rDNA
部分序列。經MEGA 3軟體及neighbor-joining分析法所建構之類
緣樹圖..................................................................................................74

圖十三、Antrodia 不同菌種以ITS4與ITS5增幅出之ITS1 rDNA部分序
列。經MEGA 3軟體及neighbor-joining分析法所建構之類緣樹 圖.........................................................................................................75
圖十四、Antrodia 不同菌種以ITS4與ITS5增幅出之ITS2 rDNA部分序
列。經MEGA 3軟體及neighbor-joining分析法所建構之類緣樹
圖......................................................................................................76
圖十五、Antrodia 內十三種不同種之液體培養菌絲之甲醇萃取液初步純化
分析之高效液相層析（HPLC）圖譜................................................77
圖十六、Antrodia之屬十六種不同菌種菌絲體甲醇萃取物（100 μg/ml），對
肝癌細胞株Hep G2之生理活性影響..............................................78
圖十七、Antrodia之屬十六種不同菌種菌絲體甲醇萃取物（100 μg/ml），對
肺癌細胞株A549之生理活性影響..................................................79
圖十八、Antrodia之屬十六種不同菌種菌絲體甲醇萃取物（100 μg/ml），對
小鼠纖維母細胞株NIH-3T3之生理活性影響................................80
圖十九、樟芝分離株I之菌絲體乙酸乙酯層分液（EA fraction 2、3、4）（100 μg/ml
濃度）， 對肝癌細胞株Hep G2之生理活性影響...........................81
圖二十、樟芝分離株I之菌絲體乙酸乙酯層分液（EA fraction 2、3、4）（100 μg/ml
濃度）， 對肺癌細胞株A549之生理活性影響..............................82
圖二十一、樟芝分離株I之菌絲體乙酸乙酯層分液（EA fraction 2、3、4）（100
μg/ml濃度）， 對小鼠纖維母細胞株NIH-3T3之生理活性影響..83
圖二十二、樟芝不同分離株之菌絲體甲醇抽提層分液（MeOH）與樟芝分離株I
之乙酸乙酯層分液（EA fraction 2、3、4）（濃度100 μg/ml），對肝癌 細胞株Hep G2之存活率影響................................................................84
圖二十三、樟芝不同分離株之菌絲體甲醇抽提層分液（MeOH）與樟芝分離株I
之乙酸乙酯層分液（EA fraction 2、3、4）（濃度100 μg/ml），對肺癌
細胞株A549之存活率影響....................................................................85
圖二十四、樟芝分離株I菌絲體乙酸乙酯層萃取分液（EA fraction 2、3、4）， 不同濃度（10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml）對小鼠巨噬細胞 （RAW 264.7）抗發炎之影響......................................................86




















附錄

附錄一、萃取DNA所使用之溶液...................................................................88
附錄二、增幅Antrodia 屬之不同種之18S rDNA所使用之引子、模板以及
PCR條件附錄二、增幅Antrodia 屬之不同種之18S rDNA所使用
之引子、模板以及PCR條件.............................................................89
附錄三、增幅Antrodia 屬之不同種之ITS1-5.8S-ITS2 rDNA所使用之引
子、模板以及PCR條件....................................................................90
附錄四、pGEM®-T Easy Vector system次選殖ITS1-5.8S-ITS2或18S rDNA
產物之反應試劑................................................................................91
附錄五、以MTT方法檢測癌細胞存活率之作用機轉.................................92

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