臺灣博碩士論文加值系統

當巨觀的貴重金屬微小至奈米程度時，在吸收光譜中會產生特性吸收波帶稱為表面電漿共振波帶（Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR）。LSPR波帶的吸收度及波帶位置對於金屬奈米粒子所處的外在環境折射率有高度的相關性。利用此特性，再將金屬奈米粒子表面修飾特定的辨識基團（recognition group），可發展免標示（label-free）即時偵測的光學生化感測器。並結合光纖之多次全反射的傳導原理，偵測靈敏性可大幅提昇。
本研究先將圓球型的金奈米粒子自我組裝於光纖表面，再修飾上HS-ssDNA探針及硫基乙醇（mercaptoethanol, MCE）。當與探針序列互補（complementary）之單股DNA（ssDNA）與HS-ssDNA探針進行雜交（hybridization）時，會造成金奈米粒子外有效折射率的增加，使得LSPR波帶吸收強度產生改變。我們的實驗結果顯示，HS-ssDNA探針及MCE混合單層確實對目標ssDNA有高度的專一性，對於27個鹼基的ssDNA偵測極限可達到8.09×10-11莫耳濃度，對於25個鹼基的ssDNA偵測極限可達到5.14×10-10莫耳濃度，對於19個鹼基的ssDNA偵測極限可達到1.46×10-7莫耳濃度，並且具有分辨單鹼基突變（single base mismatch）之能力，同時利用real-time RT-PCR證實可進行mRNA的定量分析。因此本方法對於疾病檢測的發展上有很高的應用潛力。
 當DNA上的鹼基被過氧化亞硝酸根（peroxynitrite）硝化後，會造成DNA上N-glycosidic鍵的水解，使得DNA上形成無嘌呤部位（apurinic sites, AP-sites），進而產生癌症及突變。本研究利用不同比例的11-mercapto-undecanoic acid（MUA）/ mercaptohexanol（MCH）溶液在金奈米粒子的表面製備自我組裝混和單層膜，再修飾上所設計的AP-sites探針，此AP-sites探針末端具有胺基（amino group）且另一端為具有tBoc保護基的胺氧基（aminooxy group），胺基能用來與MUA單層上的羧基（carboxyl group）進行耦合（coupling）反應；胺氧基能被在去保護後與AP-sites DNA上的醛基進行脫水反應，以形成共價鍵的鍵結。接著再利用LSPR波帶吸收強度的改變來製備測量含AP-sites之DNA的LSPR感測器。我們的結果顯示使用1% MUA/MCH混和單層溶液所製備出的LSPR感測器，在偵測含有AP-sites之DNA上具有較高的靈敏度，且可以避免不具有AP-sites之DNA的非特異性吸附。

The development of label-free optical biosensors for DNA or other biomolecules has the potential to impact life sciences as well as screening in medical and environmental applications. We have developed a localized surface plasmon resonance (LSPR) sensor based on gold nanoparticle modified optical fiber where the gold surface has been modified with mixed HS-ssDNA/mercaptoethanol (MCE) self-assembled monolayers (SAMs). In the SAMs, a single-strand DNA (ssDNA) probe was designed to recognize a target ssDNA or mRNA. The gold nanoparticle layer was self-assembled on glass substrates or optical fiber. The optical properties of gold nanoparticle layer were characterized through monitoring the changes in absorbance or detector signal, as the refractive index of the DNA layer increases with hybridization. The detection of targets through multiple total internal reflections in the optical fiber was performed and detection limits of 8.09×10-11M, 5.14×10-10M and 1.46×10-7M for 27 mer, 25 mer and 19 mer target ssDNA, respectively, were achieved. Selective discrimination against a single base mismatch was also demonstrated.
In another study, we attempted to detect the apurine sites (AP-sites) in DNA. The sensor was prepared by immobilization of two low-molecular-weight alkanethiols, mercaptohexanol (MCH) and mer- captoundecanoic acid (MUA) as mixed SAMs on the gold nanoparticle surface. The AP-sites detecting probe was then modified on the mixed SAMs. The AP-sites detecting probe contains an amino group on one end and a protected aminooxy group on the other end. The amino group was coupled to the carboxyl group of MUA and the deprotected aminooxy group reacted with the aldehyde group of the AP-sites. Upon binding of the AP-sites containing DNA with the AP-site detecting probe, the refractive index of the surrounding environment of the colloidal gold surface and, hence, the LSPR resonance frequency changes. The composition of the mixed SAMs was optimized by examining the change in LSPR signal with different mole percentages of MUA in the starting solution. The data showed that the optimum mole percentage of MUA in the starting solution to prepare the mixed monolayer was 1%. In this case, The mixed SAMs was resistant to nonspecific adsorption of AP-sites-free DNA.

總目錄……………………………………………………………………i
圖表目錄…………………………………………………………………v
中文摘要…………………………………………………………………I
英文摘要……………………………………………………………… III
第一章 緒論…………………………………………………………… 1
1-0 前言………………………………………………………………… 1
1-1 奈米材料…………………………………………………………… 3
1-1-1 奈米材料的簡介…………………………………………… 3
1-1-2 金屬奈米粒子的簡介……………………………………… 5
1-1-3 奈米粒子之光譜特性……………………………………… 6
1-2 光纖………………………………………………………………… 8
1-2-1 光纖的簡介………………………………………………… 8
1-2-2 光纖的結構………………………………………………… 8
1-2-3 光纖的種類………………………………………………… 9
1-2-4 內全反射現象………………………………………………11
1-2-5 逐漸消失場……………………………………………… 13
1-2-6 光纖感測器……………………………………………… 16
1-3 自我組裝單層…………………………………………………… 19
1-3-1自我組裝單層的簡介…………………………………… 19
1-3-2 混合自我組裝單層……………………………………… 20
1-4 核酸……………………………………………………………… 22
1-4-1核酸分子的簡介……………………………………………22
1-4-2 雜交反應………………………………………………… 23
1-4-3 去嘌呤位置DNA的簡介…………………………………24
1-5 生化感測器的簡介……………………………………………… 25
第二章 實驗部分………………………………………………………28
2-1 藥品及儀器設備………………………………………………… 28
2-1-1 藥品……………………………………………………… 28
2-1-2 儀器設備………………………………………………… 30
2-2 實驗步驟………………………………………………………… 32
2-2-1 圓球型金奈米粒子的製備……………………………… 32
2-2-2 金奈米粒子於玻璃片表面進行自我組裝……………… 33
2-2-3 金奈米粒子的光譜性質………………………………… 33
2-2-4 金奈米粒子於光纖表面進行自我組裝………………… 34
2-2-5 定域化表面電漿共振感測器的靈敏度………………… 35
2-2-6 微流體系統……………………………………………… 35
2-2-7 光纖式表面電漿共振感測系統………………………… 38
2-2-8 修飾HS-ssDNA探針結合MCE混合自我組裝單層……39
2-2-9 雜交條件………………………………………………… 40
2-2-10 再生條件………………………………………………… 40
2-2-11 修飾AP-sites探針混合自我組裝單層………………… 40
第三章 實驗結果與討論………………………………………………44
3-1 表面電漿共振感測平台的製備及鑑定………………………… 44
3-1-1 圓球形金奈米粒子之鑑定……………………………… 44
3-1-2 圓球形金奈米粒子自我組裝在玻璃片（GlassAu）上之鑑定
………………………………………………………………45
3-1-3 圓球形金奈米粒子自我組裝在玻璃片（GlassAu）上之光譜
特性…………………………………………………………47
3-1-4 圓球形金奈米粒子自我組裝在光纖表面（FiberAu）偵測不
同折射率蔗糖水溶液………………………………………49
3-2 表面電漿共振感測系統偵測核酸分子………………………… 51
3-2-1 修飾HS-ssDNA探針/MCE混和單層之光譜變化……… 51
3-2-2 修飾不同組成HS-ssDNA探針混和單層之光譜變化……52
3-2-3 HS-ssDNA探針/MCE混和單層自我組裝在光纖表面（FiberAu）偵測不同濃度之互補ssDNA………………… 54

3-2-4 HS-ssDNA探針/MCE混和單層自我組裝在光纖表面（FiberAu）偵測互補mRNA……………………………… 58
3-2-5 HS-ssDNA探針/MCE混和單層自我組裝在光纖表面（FiberAu）分辨單鹼基突變（single base mismatch）之能力……………………………………………………………62
3-2-6 HS-ssDNA探針/MCE混和單層自我組裝在光纖表面（FiberAu）對ssDNA感測再生之測試……………………63
3-3 表面電漿共振感測系統偵測含AP-sites之DNA……………… 67
3-3-1 AP-sites (apurine-sites) 探針混合自我組裝單層（mixed
SAMs）感測系統偵測具有AP-sites之DNA………………67
第四章 結論……………………………………………………………71
參考文獻……………………………………………………………… 74
圖1.1 巨觀材料、膠體粒子及原子之電子能階密度圖………………6
圖1.2 光纖結構示意圖…………………………………………………9
圖1.3 光纖的傳導模態……………………………………………… 11
圖1.4 光的反射與折射……………………………………………… 13
圖1.5 光的導入角度與傳播………………………………………… 13
圖1.6 以粒子說解釋光全反射時的滲透現象……………………… 15
圖1.7 以電磁波解釋光全反射時的滲透現象……………………… 15
圖1.8 逐漸消失場螢光感測器示意圖……………………………… 16
圖1.9 光纖感測器的類型…………………………………………… 18
圖1.10 理想自我組裝單層示意圖……………………………………20
圖1.11 核酸（A）及鹼基（B）的化學式…………………………22
圖1.12 雙螺旋結構（左）及Watson-Crick鹼基對（右）…………23
圖1.13 AP-sites DNA與探針進行脫水反應之示意圖……………… 24
圖2.1 圓球型金奈米粒子製備示意圖……………………………… 32
圖2.2 金奈米粒子於光纖表面自我組裝之示意圖………………… 34
圖2.3 微流體槽道…………………………………………………… 36
圖2.4 微流體晶片…………………………………………………… 36
圖2.5 注射幫浦……………………………………………………… 37
圖2.6 光纖感測系統示意圖………………………………………… 38
圖2.7 修飾HS-ssDNA探針/ MCE mixed SAMs之示意圖………… 39
圖2.8 修飾AP-sites (apurine-sites)DNA探針混合自我組裝單層之流
程圖……………………………………………………………42
圖2.9 化合物之結構式……………………………………………… 43
圖3.1 圓球形金奈米粒子之TEM照片………………………………44
圖3.2 圓球形金奈米粒子之粒徑分佈……………………………… 45
圖3.3 圓球形金奈米粒子之吸收光譜（a）氯仿（b）玻璃片………46
圖3.4 圓球形金奈米粒子自我組裝在玻璃片上之SEM照片………46
圖3.5 圓球形金奈米粒子自我組裝在玻璃片上之粒徑分佈……… 47
圖3.6 GlassAu置於不同折射率溶液中之吸收光譜………………… 48
圖3.7 GlassAu置於不同折射率溶液中之吸收光譜………………… 49
圖3.8 FiberAu感測器對不同折射率之蔗糖水溶液之訊號強度變化
………………………………………………………………… 50
圖3.9 組裝HS-ssDNA探針/MCE混和單層之光譜變化……………52
圖3.10 不同組成的自我組裝單層其吸收強度改變之柱狀圖………53
圖3.11 偵測19個鹼基對目標ssDNA與訊號改變曲線圖…………56
圖3.12 偵測19個鹼基對目標ssDNA的校正曲線圖………………56
圖3.13 偵測25個鹼基對目標ssDNA的校正曲線圖………………57
圖3.14 偵測27個鹼基對目標ssDNA的校正曲線圖………………57
圖3.15 偵測mRNA之訊號改變曲線圖………………………………60
圖3.16 偵測mRNA樣品1之訊號改變曲線圖………………………60
圖3.17 偵測mRNA樣品2之訊號改變曲線圖……………………… 61
圖3.18 偵測mRNA樣品3之訊號改變曲線圖……………………… 61
圖3.19 不同序列目標ssDNA的動力學曲線…………………………63
圖3.20 注入序列互補之目標ssDNA訊號強度變化圖………………65
圖3.21 注入再生緩衝液之訊號強度變化圖…………………………65
圖3.22 注入雜交緩衝液之訊號強度變化圖………………………… 66
圖3.23 注入同濃度之序列互補之ssDNA訊號變化圖………………66
圖3.24 使用1% MUA/MCH混和自我組裝單層感測系統偵測具有AP-sites之DNA的光譜變化………………………………70
圖3.25 不同比例的MUA/MCH混和自我組裝單層偵測具有AP-sites
之DNA吸收強度改變量之柱狀圖…………………………70
表3.1 不同長度目標ssDNA之偵測極限與再現性…………………58

[1] Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L.; Mucic, R. C.; Storhoff, J. J. Nature
1996, 382, 607.
[2] Taton, T. A.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Science 2000, 289,
1757
[3] Feynman, R. P. Science 1991, 254, 1300.
[4] Brus, L. E.; Efros, A. L.; Itoh, T. Langmuir 1996, 70, R7-R8.
[5] Weller, H. Philo. Trans. R. Soc. London, Ser. A 1996, 354, 757.
[6] Kalyanasundaram, K.; Borgarello, E.; Duonghong, D.; Gratzel, M.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1981, 20, 933.
[7] Stepanyuk, V. S.; Hergert, W.; Rennert, P.; Wildberger, K.; Zeller, R.; Dederichs, P.H.; Surf. Sci. 1997, 377. 495.
[8] Buffat, P. H.; Borel, J. P. Phys. Rev. A 1976, 13, 2287.
[9] Golden, A. N.; Echer, C. M.; Alivisatos, A. P. Science 1992, 256,
1425.
[10] Bawendi, M.; Stierderwald, M. L.; Brus, L. E. Ann. Rev. Phys.
Chem. 1990, 4, 447.
[11] Wang, Y.; Herron, N. J. J. Phys. Chem. 1991, 95, 525.
[12] Siegel, R. Nanostructured Mater. 1993, 3, 1.
[13] Creighton, J. A.; Eadon, D. G. J. Chem. Soc. Faraday. Trans. 1991,
87, 3881.
[14] 張仕欣、王崇人,化學 1998, 56, 209.
[15] Wang, D. S.; Ketxer, M. Phys. Rev. B. 1981, 24, 1777.
[16] 田蔚城, 生物技術的發展與應用, 2001.
[17] Matsubara, K.; Kawata, S.; Minami, S. Appl. Spectrosc., 1988, 42, 1375-1379.
[18] Liedberg, B.; Lundstrom, I. E. Stenberg, Sens. Actuators B, 1993, 11, 63-72.
[19] 楊正義、陳吉峰、葉怡均、陳正龍、陳家俊, 物理雙月刊2001, 23.
[20] Kang, L.; Dessy, R. E. Anal. Chem., 1990, 21, 377-388.
[21] Senior, J. M. Optical Fiber Communications: Principles and
Pracetice, Prentice/Hall International, 1985, 10-12.
[22] Senior, J. M. Optical Fiber Communications: Principles and
Pracetice, Prentice/Hall International, 1985, 32-34.
[23] 林愷, 光纖通訊系統, 全華科技出版, 1990.
[24] 吳順正, 光纖特性與應用, 全華科技出版, 1989.
[25] Janata, J. Principles of Chemical Sensors, Plenum Press, 1989.
[26] Potyrailo, R. A.; Holbbs, S. E.; Hieftje, G. M. Anal. Chem. 1998, 362, 349-373.
[27] Love, J. C.; Estroff, L. A.; Kriebel, J. K.; Nuzzo, R. G.; Whitesides, G.. M. Chem. Rev. 2005, 105(4), 1103-1170.
[28] Levicky, R.; Herne, T. M.; Tarlov, M. J.; Satija, S. K. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 9787-9792.
[29] Liu, X.; Tan, W. Anal. Chem. 1999, 71, 5054-5059.
[30] Wong, E. L. S.; Chow, E.; Gooding, J. J. Langmuir 2005, 21, 6957-6965.
[31] Lahiri, J.; Isaacs, L.; Grzybowski, B.; Carbeck, J. D.; Whitesides, G. M. Langmuir 1999, 15, 7186-7198.
[32] Mulvaney, p. Langmuir 1996, 12, 788-800.
[33] Peterson, A. W.; Wolf, L. K.; Georgiadis, R. M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14601-14607.
[34] Endo, T.; Kerman, K.; Nagatani, N.; Takamura, Y.; Tamiya, E. Anal. Chem. 2005, 77, 6976-6984.
[35] Nath, N.; Chilkoti, A. Anal. Chem., 2002, 74, 504-509.
[36] Daniel, M. C.; Astruc, D. Chem. Rev. 2004, 104, 293-346.