臺灣博碩士論文加值系統

摘要
相較微生物系統以及哺乳類動物系統而言，以植株系統來生產外源蛋白有著更經濟，更安全等優勢。因此，植株生產系統目前已逐漸受到世人的注目。然而，由於植株生產系統無法精確地控制成長，以及缺乏工業放大之可行性。植物細胞系統可擁有植株系統之優點，且又可避免掉上述之缺點，故本研究遂採用植物細胞生產系統來取代植株系統。
在本研究中，吾人運用受到缺糖所誘導之水稻αAmy3啟動子來生產人類血清蛋白（此血清廣泛地使用於世上），並藉由signal peptide來將人類血清蛋白外泌至培養基中。以錐形瓶來進行培養，相較於MS培養基，使用N6培養基可將產量由22 mg / L 提升至50 mg / L。
此外，吾人證實藉著添加Proline於N6培養基可提升產量至60 mg / L。其提升的原因可能是Proline在缺糖時期，維持細胞滲透壓，抵擋水合作用所產生的胞裂現象亦或是Proline被視為氮源來使用。另外，在重複生產的過程中，其產量可達至49 mg / L。然而，在氣舉式反應器的放大製程中，於缺糖生產五天後其產量只有18 mg / L。
雖然最終產量未能符合預期，但是相信藉著培養政策之最適化以及培養基之修正，未來水稻懸浮細胞生產體系必能成為生產醫藥用外源蛋白之最有潛力的系統。

Abstract
The utility of whole plants for the recombinant protein production has received a great deal of attention recently because of its advantage in economy and safety compared to traditional microbial and mammalian production systems. However, there is still some deficiency in whole plant production, including the unstable growth conditions control and the poor ability to scale up. The Plant cell culture system can combine the advantages of whole plants and avoid above disadvantages.
In the study, we showed the expression of human serum albumin（HSA）by sucrose starvation-inducible rice αAmy3 promoter and secretion to medium by using signal peptide. In the flask scale culture, N6 medium could increase HSA productivity from 22 mg / L to 50 mg / L compared to MS medium. Furthermore, we demonstrated that adding proline level in N6 medium could enhance HSA production to 60 mg / L. Possible functional roles of Proline may include: cytoplasmic osmoticum, the hydration of polymers and serving as a nitrogen source compound during period of sugar starvation. Additionally, in repeated sucrose provision-depletion cycles, the N6 medium also showed the amount of HSA accumulated reached up 49 mg / L. However, in the airlift bioreactor scale up process, the HSA production only reached 18 mg / L five days after sucrose deletion.
Although a final yield of HSA cannot achieve the expectation, the rice suspension cell culture showed high potential to become the most important system for the production of recombinant pharmaceutical protein by optimum cultivation strategies and modified medium.

總目錄
指導教授推薦書………………………………………………………
口試委員審定書………………………………………………………
長庚大學授權書………………………………………………………iii
致謝……………………………………………………………………iv
中文摘要………………………………………………………………v
英文摘要………………………………………………………………vi
總目錄…………………………………………………………………vii
圖目錄…………………………………………………………………xi
表目錄…………………………………………………………………xiii
第一章 緒論……………………………………………………………1
1.1 前言……………………………………………………………1
1.2 研究動機與目的………………………………………………2
第二章 文獻回顧………………………………………………………4
2.1 利用基因改良的生物細胞生產外源蛋白質…………………4
2.1.1 微生物生產系統…………………………………………5
2.1.2 動物生產系統……………………………………………6
2.1.3 植物生產系統……………………………………………7
2.2 基因轉殖水稻細胞生產外源蛋白質…………………………10
2.2.1 基因轉殖水稻細胞………………………………………10
2.2.2 利用水稻α-澱粉水解酵素啟動子（α-amylase 3 promoter）
表現外源蛋白………………………………………………10
2.3 人類血清蛋白（human serum albumin，HSA）…………12
2.4 植物細胞培養政策……………………………………………15
2.4.1 植物培養細胞的生理特性…………………………………15
2.4.2 懸浮培養法………………………………………………15
2.4.3 固定化培養法……………………………………………17
2.4.4 缺糖處理…………………………………………………20
2.4.5培養環境之培養基探討……………………………………21
2.4.5.1 N6培養基之內含物Proline……………………………21
2.4.6 植物細胞培養之操作模式…………………………………22
2.4.7 懸浮培養之生化反應器……………………………………24
2.4.8 固定化培養之生化反應器…………………………………29
2.5 實驗架構…………………………………………………………31
第三章 研究材料與方法…………………………………………………33
3.1 實驗設備…………………………………………………………33
3.2 實驗藥品…………………………………………………………34
3.3 實驗方法…………………………………………………………37
3.3.1 水稻癒傷組織的誘導與建立………………………………37
3.3.2 懸浮細胞培養………………………………………………38
3.3.2.1 懸浮細胞培養系統的建立與繼代……………………38
3.3.2.2 以自然缺糖法來生產人類血清蛋白…………………40
3.3.2.3 最適培養基的篩選……………………………………41
3.3.2.4 最佳培養方式的確立…………………………………41
3.4 分析方法…………………………………………………………41
3.4.1 細胞濕重與乾重測定………………………………………41
3.4.2 細胞活性測試（TTC assay）……………………………41
3.4.3 醣類測定（酚-硫酸法）……………………………………43
3.4.4產物HSA分析…………………………………………………43
3.4.4.1電泳分析及染色………………………………………43
3.4.4.2西方轉漬法（Western blot analysis）………45
3.4.4.3 酵素聯結免疫分析(enzyme linked immunosorbent
assay，ELISA)………………………………………46
第四章 結果與討論……………………………………………………48
4.1 懸浮細胞培養生產人類血清蛋白……………………………48
4.1.1 以自然缺糖法來達到缺糖環境……………………………48
4.1.2最適培養基的篩選…………………………………………49
4.1.3 調整培養基之內部成分……………………………………53
4.1.4 以人工缺糖法來確定Proline之功用……………………55
4.1.5 調整N6培養基內含Proline之比例………………………61
4.1.6 以N6培養基搭配上自然缺糖法來進行批次培養、半連續式
培養……………………………………………………………63
4.1.6.1 批次培養………………………………………………………63
4.1.6.2重複培養………………………………………………………65
4.1.7利用1L內循環式氣舉反應器來進行懸浮細胞之自然缺糖培
養生產…………………………………………………………68
4.1.8利用5L內循環式氣舉反應器來進行懸浮細胞之自然缺糖培
養生產…………………………………………………………72
第五章 結論……………………………………………………………77
參考文獻…………………………………………………………………78

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