臺灣博碩士論文加值系統

中文摘要

本研究探討四種不同固定化載體矽藻土Diatomaceous earth FW-14 、 Celite 560 、孟宗竹炭( Moso bamboo charcoal )、 Chitopearl 3520，以吸附法固定化獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）生產透明質酸。吾人發現搖瓶重覆批次培養中，以統計方法單因子變異數分析，比較每個重覆批次24小時之取樣點，懸浮培養（控制組）與四種固定化載體培養有顯著的差異，再以信賴區間做圖比較，其結果表現出以孟宗竹炭當固定化載體於每個重覆批次中，具有最好的操作穩定性，為這四種載體中最適合當固定化獸疫鏈球菌株之載體。
填充床式循環反應器系統中，以孟宗竹炭為填充床反應器中的固定化載體進行固定化實驗，於本系統中最佳固定化條件為，以1 g/l幾丁聚醣（chitosan）溶液塗佈於孟宗竹炭上，固定化起始菌體濃度為5 g/l左右在0.5 ml/min循環流速時，其菌體固定化百分比可達80％以上。在最佳固定化批次醱酵條件中，以37 ℃、pH = 7.0、300 rpm、10 g/l起始葡萄糖濃度，進行固定化批次醱酵，透明質酸濃度為1.47 g/l，反應器產率可達4.58 g/h*l、及0.14葡萄糖轉化率，而固定化重覆批次可重覆至六次，透明質酸產量可穩定維持在1.2 g/l左右。

Abstract
The purpose of this research is to immobilize Streptococcus zooepidemicus by adsorption onto four different kinds of support, diatomaceous earth FW-14, Celite 560, Moso bamboo charcoal, and Chitopearl 3520, for production of hyaluronic acid.
From results of repeated batch fermentation and one-way ANOVA analysis, Moso bamboo charcoal demonstrates the best operation stability in each repeated batch cycle and was chosen for further bioreactor study. The best immobilization condition is with 1 g/l chitosan-treated Moso bamboo charcoal, 5 g/l initial biomass loading, and 0.5 ml/min circulation velocity. The cell immobilization efficiency is more than 80% in this case. The best batch fermentation condition is 37 ℃, pH 7.0, 300 rpm, and 10 g/l initial glucose concentration. This system can produce 1.47 g/l hyaluronic acid and the productivity and glucose yield are 4.58 g/h/l and 0.14 g/g, respectively. Repeated batch fermentation experiments showed that immobilized cells could be reused for up to six times and hyaluronic acid concentration can be maintained at 1.2 g/l.

目　　錄
第一章 序論 1
1.1 前言 1
1.2 研究動機 2
第二章 文獻回顧 3
2.1玻尿酸的介紹 3
2.1.1透明質酸的由來與結構 3
2.1.2 透明質酸的生理性質 4
2.1.2.1分子篩效應 4
2.1.2.2高度水合性質 5
2.1.2.3流變性質與黏彈性質 5
2.1.3透明質酸的應用 6
2.1.3.1醫學上應用 6
2.1.3.2美容與化妝品上應用 7
2.1.3.3透明質酸化學修飾及其應用 7
2.2透明質酸的生產 8
2.2.1透明透酸的來源 8
2.2.2 生產透明質酸菌株改良 9
2.2.3透明質酸的生化合成 9
2.3固定化微生物 13
2.3.1固定化細胞(微生物)的定義 13
2.3.2 固定化載體選擇 13
2.3.3 固定化細胞(微生物)的方法 14
2.4 固定化文獻回顧 16
2.5 填充床反應器之操作原理 18
2.6單因子變異數分析 20
第三章 實驗材料與方法 22
3.1實驗材料與藥品 22
3.1.1固定化載體 22
3.1.2實驗藥品 22
3.1.3實驗儀器 23
3.1.4實驗裝置 25
3.2實驗設計流程 27
3.3 菌種來源及培養基組成 28
3.3.1菌種來源 28
3.3.2培養基組成 28
3.4 實驗方法 29
3.4.1菌體前培養 29
3.4.2懸浮菌體重覆批次培養 29
3.4.3重覆批次搖瓶固定化培養 30
3.5循環式填充床反應器 31
3.5.1 菌體固定化（循環式固定化系統） 31
3.5.2 固定化菌體批次醱酵 32
3.6實驗分析方法 35
3.6.1透明質酸濃度測定（高效液相層析儀） 35
3.6.2菌體生質量測定 36
3.6.3殘餘葡萄糖濃度測定 37
3.6.4掃描式電子顯微鏡之前處理 38
第四章 結果與討論 39
4.1懸浮菌體與固定化菌體重覆批次培養（搖瓶） 39
4.1.1統計分析 43
4.2 搖瓶固定化菌體型態 47
4.3影響菌體固定化參數(循環式固定化系統) 51
4.3.1循環流速影響 51
4.3.2不同起始菌體濃度影響 55
4.3.3不同幾丁聚醣濃度影響 58
4.4固定化菌體批次醱酵（循環式填充床反應器系統） 62
4.4.2酸鹼值影響 67
4.4.3幾丁聚醣濃度影響 71
4.4.4葡萄糖濃度影響 75
4.4.5攪拌與溶氧對固定化菌體影響 79
4.5固定化重覆批次醱酵 88
4.6批次醱酵固定化菌體型態 92
第五章 結論 97

參考文獻
1.Lubomır L. J., Lubomır L., “Hyaluronan:Preparation, Structure, Properties, and Application” Chemical Reviews, 98, 2663-2684 (1998)
2.Hoffman A. S.,“Hydrogels for biomedical applications” Adv. Drug Deliv. Rev, 43, 3-12（2002）
3.Hascall V. C., Laurent T. C., “ Hyaluronan: Structure and Physical Properties ”http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA01/HA01E.html. ( 1997 )
4.蔡秉宏, 楊炯琳 , ”透明質酸簡介以及生物醫學應用” 化工科技與商情, 05, 39-42,（2002）
5.Manuskiatti W., Maibach H., “ Hyaluronan and skin ” Cosm. & Toil., 111(10), 89-90 (1996)
6.Balazs E.A., “ Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof “ Biotrics Inc: US PATENT 4141973（1979）
7.Armstrong D. C., Johns M. R., “ Culture conditions affect the molecular weight properties of hyaluronic acid produced by Streptococcus Zooepidemicus” Appl. Environ. Microbiol., 63, 2759-2764 (1997)
8.孟慶繁., 滕利榮., 洪水聲., 陳佳., 王亞軍., 吳敏., 劉蘭英., ” 透明質酸産生菌的化學誘變及發酵條件探索 ”吉林大學學報(理學版), 42卷1期, 121-125 （2004）
9.Takshi Y., Takeru K., “ Microbial Synthesis of Hyaluronan and Chitin: New Approaches” J. B. Bioengineering, 99, 521–528（2005）
10.Dougherty B. A., Van De Rijn I., “ Molecular chracterization of hasA from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A Streptococci. “ J. Biol. Chem., 269, 169-175（1994）
11.Dougherty B.A., Van de Rijn I., “ Molecular characterization of hasB from an operon required for hyaluronic acid synthesis in group A streptococci. Demonstration of UDP-glucose dehydrogenase activity. “ J. Biol. Chem., 268, 7118-7124（1993）
12.De Angelis P., Papaconstantinou J., Weigel P.H., “ Isolation of a Streptococcus pyogenes gene locus that directs hyaluronan biosynthesis in acapsular mutants and in heterologous bacteria.“ J Biol Chem., 268, 14568-14571（1993）
13.Ashbaugh C. D., Albert S., Wessels M.R ., “ Molecular analysis of the capsule gene region of group A Streptococcus the hasAB genes are sufficient for capsule expression ” J. Bacteriology, 180, 4955-4959（1998）
14. Claudio D. L., Manfred L., Irene M., ” Enzymatic synthesis of hyaluronic acid with generation of sugar nucleotides ” J. Am. Chem. Soc., 117 5869-5870（1995）
15. Rehm H. J., Reed G., “Biotechnology. ” Chapter 8. 406-457
16. Jun-ichi H., ” Continuous acetic acid production by a packed bed bioreactor employing charcoal pellets derived from waste mushroommedium” J. Bioscience Bioengineering, 89, 126-130（2000）
17 Kenji S., Noppawan C., Naoyuki E.,” Biosynthetic production of nisin Z by immobilized Lactococcus lactis ” Journal of molecular catalysis, 10, 325-334, (2000)
18Anderson W. A.,. “ Adsorption of Streptococcus faecalis on diatomite carriers for use in biotransformations.” J. Chem. Technol. Biotechnol, 47, 93-100（1990）
19Sudha K,. MK Gowhtaman,. MC Misra,. “ Chitosan-treated polypropylene matrix as immobilization support for lactic production using Lactobacillus planterum NCIM2084” J. Chem. Technol. Biotechnol, 76, 461-468 (2001)
20A. Senthuran., V. Senthuran., B. Mattiasson ., R. Kaul., “ Lactic acid fermentation in a recycle batch reactor using immobilized Lactobacillus casei” Biotechnology and bioengineering, 841-853 (1996)
21呂理平., “ 固定床反應器 ” 化工技術, 3(3) ,78-78 ,（1995）
22林祺能., 吳石乙., “以三相流體化床進行固定化細胞產氫“碩士論文, 逢甲大學化學工程研究所, p 57, (2002)
23D. C Montgomery., G. C. Runger., N. F. Hubele., “Engineering statistics ” 3rd ed, John Wiely & Sons（2004）
24吳逢倉., ” 微生物醱酵生產透明質酸程序開發“　碩士論文, 長庚大學, p 25, (2005)
25高海軍, 陳堅, 堵由成, “攪拌與混合對獸疫鏈球菌生產透明質酸影響” 化工學報 , 54(3), 350-356 (2003)
26Kim J. H., Yoo S. J., Oh D. K., Kweon Y. G., Park D. W., Lee C. H., ” Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid.” Enzyme and Microbial Technology , 19 , 440-445（1996）
27Armstrong D. C., M. J. Coony., M. R. Johns., “Culture conditions affect the molecular weight properties of hyaluronic acid produced by Strptococcus zooepidemicus.” Appl. Environ. Microbiol., 63, 2759-2764 （1997）