臺灣博碩士論文加值系統

近年來，肝病已成為國人十大死亡原因的前幾名，因此發展一既簡便又快速的肝功能生物感測器便成為重要的研究主題。一直以來，化學網版修飾電極在電化學的偵測上就很容易受到檢體成份的干擾，而且傳統電極的造價昂貴而且容易受到污染，因此我們以化學網版修飾電極來取代一般的傳統電極。本論文是利用浸泡的方式將塗覆物質包括 Meldola’s Blue、麩胺酸去氫酶（NADH）、輔酶（NAD+）及介面活性劑（CMC與Tween 20）固定在吸附層（不織布）的表面，製備成化學網版修飾電極後再利用循環伏特安培法（cyclic voltammetry）及安培電流法（amperometry）來進行測試。
本研究以網版印刷電極針對（1）塗覆物質的各成分（2）測試轉胺酶ALT的活性（3）全血，來進行的檢測。由實驗結果顯示，自製之化學網版修飾電極的變異係數（CV）約為10 %，在測量ALT試劑的操作電位設定在0.1 V時，可以有效地偵測到電流訊號。在室溫下操作，反應時間為3分鐘，可以測得ALT的線性範圍在30∼300 U/L，R＝0.9961（n＝5）。
這些結果雖然仍不盡理想，但相信如果再進一步修正塗覆物質的種類與比例，必能提升對偵測ALT之靈敏度及線性範圍，而些部份的研究也將是我們持續努力的方向。

For the past few years ,liver disease has become one of the main reason to cause people’s death . It is crucial to develop a method which is cheap , fast and accurate to liver function detection. Because of some excellent characteristic of chemical modified electrodes (CMEs) , such as low contamination by the matrix , low cost , mass production, flexibility and disposable type , the traditional electrodes have been replaced by the chemical modified electrodes .
In this thesis , CMEs was produced by the method of screen printing , reagents that thesis including Meldola’s Blue , NADH , NAD+ , CMC and Tween 20 are coated on a reaction medium which is on the electrode surface . Chemical modified electrodes were tested by the methods of cyclic voltammetry and amperometry with the usage of (1) the components of the reagents that make up the
CMES ,(2) Alanine aminotransferase (ALT) and(3) whole blood . The result shows that , the precision of the CMEs is about 10% . The
dynamic range is 30~300 U/L for ALT determination , tested at the potential of 0.1V . The response time is 3 minutes , which indicated that the method is highly effective in the detection of ALT activity .
According to above results , we believe that the CMEs can be improved by varing the reagents that coated on the surface of the electrode and the preparation conditions , and the sensitivity and dynamic range of ALT determination can be improved as well .

目 錄
中文摘要----------------------------------------------------------------------------Ι
ABSTRACT-----------------------------------------------------------------------Ⅱ
誌 謝--------------------------------------------------------------------------------Ⅲ
目 錄--------------------------------------------------------------------------------Ⅴ
圖目錄------------------------------------------------------------------------------Ⅵ
表目錄------------------------------------------------------------------------------Ⅶ
中英文縮略語對照表-----------------------------------------------------------X

第一章 緒論-----------------------------------------------------------------------1
1-1 前言-----------------------------------------------------------------------1
1-2 化學修飾電極簡介-----------------------------------------------------3
1-3 轉胺酶的簡介----------------------------------------------------------13
1-3-1 ALT/AST的簡介---------------------------------------------------15
1-3-2偵測轉胺酶的方法---------------------------------------------18
1-4 NADH 簡介------------------------------------------------------------23
1-5 循環伏特安培法簡介（cyclic voltammetry）------------------27
1-6 循環安培法簡介(chronoamperometry)--------------------------29
1-7 Meldola's Blue 簡介-------------------------------------------------30

第二章 實驗部分-------------------------------------------------------------34
2-1 實驗目標---------------------------------------------------------------34
2-2 實驗原理---------------------------------------------------------------35
2-3 儀器設備---------------------------------------------------------------39
2-4藥品----------------------------------------------------------------------40
2-5 溶液配製---------------------------------------------------------------41
2-6電極試片結構圖-------------------------------------------------------42
2-7 實驗步驟---------------------------------------------------------------43

第三章 結果與討論-----------------------------------------------------------49
3-1 化學修飾網版印刷電極的製備----------------------------------- 49
3-2 以電極試片來ALT對進行測試----------------------------------73
3-3 檢測全血---------------------------------------------------------------79

第四章 結論-------------------------------------------------------------------81
參考文獻-------------------------------------------------------------------------86
圖目錄

圖一 常見的幾種有機電子媒介物質--------------------------------------------8
圖二 常見的幾種有機金屬電子媒介物質--------------------------------------9
圖三 胺基轉移作用反應的通式------------------------------------------------14
圖四 ALT胺基轉移反應--------------------------------------------------------14
圖五 比色法反應式---------------------------------------------------------------19
圖六 動力學法反應式------------------------------------------------------------20
圖七 NADH氧化還原形式------------------------------------------------------23
圖八 循環伏安圖譜分析---------------------------------------------------------28
圖九 循環安培法圖譜分析------------------------------------------------------29
圖十 總反應步驟------------------------------------------------------------------36
圖十一 Meldola’s Blue與NADH在電極表面的電子轉移反應---------37
圖十二 化學修飾物在電極表面反應的途徑---------------------------------38
圖十三 電極試片結構圖---------------------------------------------------------42
圖十四 不同pH值及濃度的緩衝液折線圖----------------------------------52
圖十五 添加不同濃度NAD+的折線圖----------------------------------------55
圖十六 添加不同濃度GLDH的折線圖--------------------------------------58
圖十七 試片中含有 4 mM的NAD+在不同濃度L-glutamate
的CV圖-------------------------------------------------------------------59
圖十八 試片中含有 1.2 U/μl的GLDH在不同濃度L-glutamate
的CV-----------------------------------------------------------------------59
圖十九 添加不同濃度2-oxoglutarate的折線圖-----------------------------63
圖二十 添加不同濃度L-alanine的折線圖-----------------------------------67
圖二十一 試片中含有 1 mM的2-oxoglutarate在不同濃度
L-glutamate的CV圖-----------------------------------------------68
圖二十二 試片中含有 100 mM的L-Alanine在不同濃度
L-glutamate的CV圖-----------------------------------------------68
圖二十三 比較有無添加界面活性劑與增稠劑在不同濃度
L-glutamate的CV圖----------------------------------------------72
圖二十四 在室溫下添加不同濃度ALT的CV圖--------------------------74
圖二十五 給予熱源後添加不同濃度ALT的CV圖-----------------------76
圖二十六 給予熱源後添加不同濃度ALT的CA圖-----------------------77
圖二十七 給予熱源後添加不同濃度ALT的檢量線-----------------------78
圖二十八 給予熱源後在全血中添加不同濃度ALT的CV圖-----------80


表目錄

表一 固定化酵素方法的分類--------------------------------------------------11
表二 轉氨酶活性在人體組織中的分佈--------------------------------------16
表三 轉胺酶之各種測定法-----------------------------------------------------18
表四 近來測試AST / ALT的方法--------------------------------------------22
表五 1970年已發展出的去氫酶與NAD+的反應機構--------------------25
表六 以Meldola’s Blue為化學修飾電極的文獻比較---------------------32
表七 以Meldola’s Blue為化學修飾電極的文獻比較---------------------33
表八 實驗用儀器------------------------------------------------------------------39
表九 實驗用藥品-----------------------------------------------------------------40
表十 pH 5.0，濃度0.1 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號---------------------------------------------------------------------50
表十一 pH 5.5，濃度0.05 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號-------------------------------------------------------------------50
表十二 pH 7.0，濃度0.1 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------51
表十三 pH 7.0，濃度0.05 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------51
表十四 pH 10.0，濃度0.1 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------51
表十五 pH 10.0，濃度0.05 mM的緩衝液在各濃度NADH的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------51
表十六 試片中含有 2 mM的NAD+在各濃度L-glutamate的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------54
表十七 試片中含有 4 mM的NAD+在各濃度L-glutamate的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------54
表十八 試片中含有 6 mM的NAD+在各濃度L-glutamate的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------54
表十九 試片中含有 8 mM的NAD+在各濃度L-glutamate的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------54
表二十 試片中含有 10 mM的NAD+在各濃度L-glutamate的CV
電流訊號------------------------------------------------------------------54
表二十一 試片中含有 0.0 U/μL的GLDH在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------57
表二十二 試片中含有 0.4 U/μL的GLDH在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------57
表二十三 試片中含有 0.8 U/μL的GLDH在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------57
表二十四 試片中含有 1.2 U/μL的GLDH在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------57
表二十五 試片中含有 1.6 U/μL的GLDH在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------57
表二十六 試片中含有0.0 mM的2-oxoglutarate在各濃度
L-glutamate的CV電流訊號-------------------------------------62
表二十七 試片中含有1.0 mM的2-oxoglutarate在各濃度
L-glutamate的CV電流訊號-------------------------------------62
表二十八 試片中含有2.0 mM的2-oxoglutarate在各濃度
L-glutamate的CV電流訊號-------------------------------------62
表二十九 試片中含有3.0 mM的2-oxoglutarate在各濃度
L-glutamate的CV電流訊號-------------------------------------62
表三十 試片中含有4.0 mM的2-oxoglutarate在各濃度
L-glutamate的CV電流訊號-------------------------------------62
表三十一 試片中含有0.0 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------65
表三十二 試片中含有10 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------65
表三十三 試片中含有50 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------65
表三十四 試片中含有80 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------65
表三十五 試片中含100 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------66
表三十六 試片中含120mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------66
表三十七 試片中含150 mM的 L-alanine在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號------------------------------------------------------66
表三十八 試片中添加CMC在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------71
表三十九 試片中添加Triton在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號-------------------------------------------------------71
表四十 試片中添加Tween 20在各濃度L-glutamate
的CV電流訊----------------------------------------------------------71
表四十一 試片中添加PVA在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號----------------------------------------------------71
表四十二 試片中添加CMC與Tween 20在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號----------------------------------------------------71
表四十三 試片中無添加任何界面活性劑在各濃度L-glutamate
的CV電流訊號----------------------------------------------------71
表四十四 添加不同濃度ALT的CV電流訊號-----------------------------74
表四十五 給予熱量後添加不同濃度ALT
的CV電流訊號------------------------------------------------------76
表四十六 給予熱量後添加不同濃度ALT的CA電流訊號--------------77
表四十七 給予熱量後測量在全血中添加不同濃度ALT
的CV電流訊號------------------------------------------------------79

參考文獻
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