臺灣博碩士論文加值系統

本研究將商品（見大吉，Xentari）中的蘇力菌鮎澤亞種（Bacillus thuringiensis subsp. aizawai）之cry1Aa、cry1Ab、cry1C及cry1Da四個基因分別選殖於無質體蘇力菌Cry-B受體細胞中表現。當cry1Aa、cry1Ab、cry1C及cry1Da四株重組菌株以CYS培養基進行培養，表現之總蛋白濃度分別可達到640、1700、1400及1500 μg/mL。初步生物檢定結果發現，四株重組菌株所分泌之毒素皆能對小菜蛾（三齡初）與擬尺蠖（二齡初）害蟲造成93％與96％以上之死亡率。經進一步試驗分析，當cry1Aa、cry1Ab、cry1C及cry1Da重組菌株以總蛋白濃度對擬尺蠖進行三天生物檢定試驗，結果顯示其LC50值分別為24.9、13.4、7.3及13.2 μg/mL。本研究嘗試以二齡初擬尺蠖為試驗對象，利用回應曲面法尋求不同重組菌株表現之蛋白質最適混拌配比。結果顯示，當cry1Ab及cry1C重組菌株表現出之總蛋白濃度以27.8及24.6 μg/mL進行混拌時，擬尺蠖之平均死亡率為97.8％。

Four cry genes (cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1Da) were cloned separately from a commercial product Xentari (based on Bacillus thuringiensis subsp. aizawai) and expressed in an acrystalliferous B. thuringiensis (Cry-B) respectively. Total protein produced by recombinant strains of cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1Da were 640, 1700, 1400 and 1500 μg/mL respectively which caused more than 93% mortality against Plutella xylostella (3rd-instar larvae) and 96% mortality against Trichoplusia ni (2nd-instar larvae).
The LC50 expressed in ppm of the total protein against 2nd-instar larvae of T. ni from recombinant strains of cry1Aa, cry1Ab, cry1C and cry1Da after 72 h incubation were 24.9, 13.4, 7.3 and 13.2 μg/mL respectively. Response surface methodology (RSM) was applied to find the optimal ratio of protein combination from different recombinant strains against 2nd-instar larvae of T. ni.
Results showed that the optimal ratio of protein mixture from cry1Ab and cry1C was 27.8 and 24.6 μg/mL respectively, which gave a mortality of 97.8% against 2nd-instar larvae of T. ni.

中文摘要 I
Abstract II
誌謝 III
目錄 IV
表目錄 VI
圖目錄 VII

第一章 緒論 1
1-1 前言 1
1-2 文獻回顧 3
1-2-1 蘇力菌之特性 3
1-2-2 蘇力菌殺蟲晶體蛋白基因之分類 3
1-2-3 蘇力菌殺蟲晶體蛋白質之結構與功能 7
1-2-4 蘇力菌殺蟲晶體蛋白質之作用機制 8
1-2-5 蘇力菌的應用 9
1-3 實驗目的與動機 13
第二章 蘇力菌殺蟲基因之選殖 21
2-1 前言 21
2-2 材料與方法 22
2-3 結果與討論 34
第三章 蘇力菌殺蟲基因之表現 69
3-1 前言 69
3-2 材料與方法 71
3-3 結果與討論 76
第四章 利用回應曲面法設計蘇力菌毒素產物最適配比之初步探討92
4-1 前言 92
4-2 材料與方法 93
4-2-1 回應曲面法之實驗設計 93
4-2-2 回應曲面法原理 94
4-2-3 二水準因子設計（two-level factorial design） 95
4-2-4 陡升路徑法（method of path steepest ascent, PSA） 97
4-2-5 中心混成設計（central composite design, CCD） 100
4-2-6 回應曲面模式適切性之統計檢驗 100
4-2-7 實驗設計 101
4-2-8 生物活性檢定 102
4-3 結果與討論 103
第五章 結論與展望 116
參考文獻 119
附錄A 129
作者簡歷 133

表目錄
表3-1 不同供試蘇力菌株於CYS培養基培養5天後之總蛋白質含量 82
表3-2 不同樣品之蛋白質原液對甜菜夜蛾（三齡初）之生物檢定 86
表3-3 不同樣品之蛋白質原液對斜紋夜盜（三齡初）之生物檢定 87
表3-4 不同樣品之蛋白質原液對小菜蛾（三齡初）之生物檢定 89
表3-5 不同樣品之蛋白質原液對擬尺蠖（二齡初）之生物檢定 90
表3-6 利用probit analysis軟體計算不同樣品對二齡初擬尺蠖之LC5值及95%信賴區間 91
表4-1 回應曲面法一階實驗設計表 106
表4-2 回應曲面法一階實驗之結果 107
表4-3 回應曲面法陡升路徑之實驗設計表 108
表4-4 回應曲面法陡升路徑之實驗結果 109
表4-5 回應曲面法中心混成（二階）之實驗設計表 110
表4-6 回應曲面法中心混成（二階）之實驗結果 111
表4-7 二種因子中心混成實驗之回歸分析表 112
表4-8 回應曲面法中心混成（二階）之最大值 113
表4-9 X-1Ab及X-1C毒素產物以最適混拌配比混合後對二齡初擬尺蠖之生物檢定結果 114

圖目錄
圖2-1 利用1Aa22A和1Aa30B引子，針對cry1Aa基因進行聚合酵素連鎖反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、圖上方數字表聚合酵素反應時引子黏合之溫度） 43
圖2-2 利用1Ab22A和1Ab24B引子，針對cry1Ab基因進行聚合酵素連鎖反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、圖上方數字表聚合酵素反應時引子黏合之溫度） 44
圖2-3 利用1C32A和1C30B引子，針對cry1C基因進行聚合酵素連鎖反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、圖上方數字表聚合酵素反應時引子黏合之溫度） 45
圖2-4 利用1Da22A和1Da24B引子，針對cry1Da基因進行聚合酵素連鎖反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、圖上方數字表聚合酵素反應時引子黏合之溫度） 46
圖2-5 利用heat shock方式將pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C及pαHY300-1Da表現質體轉形於大腸桿菌DH5α勝任細胞中，經Bam HI、Sal I限制酵素反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、1∼4為pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C、pαHY300-1Da） 47
圖2-6 利用heat shock方式將pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C及pαHY300-1Da表現質體轉形於大腸桿菌DH5α勝任細胞中，經PCR反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、1∼4為pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C、pαHY300-1Da） 48
圖2-7 利用電穿孔方式將pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C及pαHY300-1Da表現質體轉形於蘇力菌無質體Cry-B受體細胞中，經Bam HI、Sal I限制酵素反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、1∼4為pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C、pαHY300-1Da） 49
圖2-8 利用電穿孔方式將pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C及pαHY300-1Da表現質體轉形於蘇力菌無質體Cry-B受體細胞中，經PCR反應後，以1% 洋菜膠體進行電泳之分析圖（M為1 kb DNA分子標誌、1∼4為pαHY300-1Aa、pαHY300-1Ab、pαHY300-1C、pαHY300-1Da） 50
圖2-9 選殖株Bt-1Aa中cry1Aa之核苷酸序列
（底線為起始密碼子、雙底線為終止密碼子） 52
圖2-10 選殖株Bt-1Ab中cry1Ab之核苷酸序列
（底線為起始密碼子、雙底線為終止密碼子） 54
圖2-11 選殖株Bt-1C中cry1C之核苷酸序列
（底線為起始密碼子、雙底線為終止密碼子） 56
圖2-12 選殖株Bt-1Da中cry1Da之核苷酸序列
（底線為起始密碼子、雙底線為終止密碼子） 58
圖2-13 pαHY300-1Aa表現質體於蘇力菌Cry-B受體細胞的留存性分
析（-■- without tetracyclin表塗抹在LB agar上；-●-with tetracyclin表塗抹在含有tetracyclin LB agar上) 59
圖2-14 pαHY300-1Ab表現質體於蘇力菌Cry-B受體細胞的留存性分
析（-■- without tetracyclin表塗抹在LB agar上；-●-with tetracyclin表塗抹在含有tetracyclin LB agar上） 60
圖2-15 pαHY300-1C表現質體於蘇力菌Cry-B受體細胞的留存性分
析（-■- without tetracyclin表塗抹在LB agar上；-●-with tetracyclin表塗抹在含有tetracyclin LB agar上） 61
圖2-16 pαHY300-1Da表現質體於蘇力菌Cry-B受體細胞的留存性分
析（-■- without tetracyclin表塗抹在LB agar上；-●-with tetracyclin表塗抹在含有tetracyclin LB agar上） 62
圖3-1 不同蛋白質樣品經SDS-PAGE電泳及Coomassie brilliant blue染色後之分析圖（M：蛋白質分子量標記；1~4：X-1Aa、X-1Ab、X-1C及X-1Da樣品；5：Xentari樣品；6：αHY300樣品；7：Cry-B樣品） 83
圖3-2 選殖株Bt-1Aa中cry1Aa之部分核苷酸序列，發現在2575 bp
位置上有另一終止密碼出現（雙底線及紅色單線部分為終止密碼子） 84
圖3-3 不同蛋白質樣品經Solubilized蘇力菌殺蟲晶體蛋白質的製備處理後，以SDS-PAGE電泳及銀染色之分析圖（M：蛋白質分子量標記；1：Xentari樣品；2~5：X-1Aa、X-1Ab、X-1C及X-1Da樣品；6：Cry-B樣品） 85
圖3-4 不同樣品之蛋白質原液對斜紋夜盜蟲（三齡初）試驗三天後之結果 88
圖4-1 回應曲面法實驗設計之概念圖 96
圖4-2 回應曲面法陡升路徑之概念圖 99
圖4-3 X-1Ab毒素和X-1C毒素對二齡初擬尺蠖害蟲死亡率之回應取面圖 115

洪哲穎、陳國誠（1992）回應曲面實驗設計法在微生物酵素生產之應用。化工 39，p.3-18。
高馥君（1992）回應曲面法在食品開發上的應用。食品工業 24，p.32-41。
石正人（1994）利用基因轉殖微生物以提高殺蟲活性。生物農藥研究與發展研討會專刊，5-1-5-35。
尤進欽、曾夢蛟、陳良築（1996）蘇力菌殺蟲晶體蛋白基因轉移到青花菜、花椰菜及小白菜。中國園藝 42，p.312-330。
詹明才、陳良築、張新雄（1996）蘇力菌殺蟲晶體蛋白基因在轉殖馬鈴薯的表現。中央研究院植物學彙刊 37，p.17-23。
張隆武、曾夢蛟（1997）蘇力菌殺蟲晶體蛋白基因轉移至甘藍之研究。興大園藝 22，p.61-73。
詹効松（1997）網狀內管氣舉式發酵程序生產蘇力菌δ-內毒素之探討。國立東華大學生物技術研究所碩士論文。
林志輝、黃文忠、曾經洲、陳良築（2002）含蘇力菌毒素基因cry1Aa1之轉形葉表生菌Erwinia herbicola的殺蟲活性與質體留存之分析。植物保護學會會刊 44，p.21-36。
曾經洲、高穗生、陳良築、翟建富、侯豐男（2002）蘇力菌台灣分離株cry1Ac基因之選殖與表現測試。植物保護學會會刊 44，p.185-208。
沈寅初、張一賓編著（2003）生物農藥。五南圖書出版股份有限公司。166 pp.。
何國傑、靳宗洛、葉開溫、鄭石通編譯（2003）基因工程與生物技術概論-基因選殖及DNA分析。藝軒圖書出版社。
林志輝、曾經洲、高穗生、陳良築（2003）含蘇力菌毒素基因cry1Aa1之轉形葉表生菌Erwinia herbicola的殺蟲效力與拮抗植物病原菌之分析。中華農學會報 4，p.17-29。
林志輝、曾經洲、陳良築（2003）蘇力菌毒素基因轉殖與作物蟲害防治。植物保護學會特刊 新五號（植物保護管理永續發展研討會專刊），p.137-158。
高穗生、謝奉家（2003）本土蘇力菌基因之選殖及應用。植物保護學會特刊 新五號（植物保護管理永續發展研討會專刊），p.249-258。
Aronson, A. I., Beckman, W., and Dunn, P.（1986）Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbiol. Rev., 50, p.1-24.
Box, G. E. P., and Wilson, K. B.（1951）On the experimental attainment optimum conditions. J. Roy. Statist. Soc. B13, p.1-45.
Box, G. E. P., Hunter, W. G. and Hunter, J. S.（1978）Statics for experimenters. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Bietlot, H. P., Vishnubhatla, I., Carey, P. R., Pozsgay, M., and Kaplan, H.（1990）Characterization of the cysteine residues and disulphide linkages in the protein crystal of Bacillus thuringiensis. Biochem. J., 267, p.309-315.
Bradley, D., Harkey, M. A., Kim, M. K., Biever, K. D., and Bauer, L. S.（1995）The insecticidal CryIB crystal protein of Bacillus thuringiensis ssp. thuringiensis has dual specificity to coleopteran and lepidopteran larvae. J. Invertebr. Pathol., 65, p.162-173.
Carlson, C. R., and Kolstoe, A. B.（1993）A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome. J. Bacteriol., 175, p.1053-1060.
Crickmore , N., Zeigler, D. R., Feitelson, J., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., and Dean, D. H.（1998）Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, p.807-813.
Chak, K. F., Tseng, M. Y., and Yamamoto, T.（1994）Expression of the crystal protein gene under the control of the α-amylase promoter in Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Microbiol., 60, p.2304-2310.
Cheng, P., Wu, L., Ziniu, Y., and Aronson, A.（1999）Subspecies-dependent regulation of Bacillus thuringiensis protoxin genes. Appl. Environ. Microbiol., 65, p.1849-1853.
Crickmore, N., Zeigler, D. R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Bravo, A., and Dean, D. H.（2005）Bacillus thuringiensis toxin nomenclature.
http://www.boils.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html（Dec 10, 2005）.
de Maagd, R. A., Bravo, A., and Crickmore, N.（2001）How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet., 17, p.193-199.
Ferre, J., Real, M. D., Van Rie, J., Jansens, S., and Peferoen, M.（1991）Resistance to the Bacillus thuringiensis bioinsecticide in a field population of Plutella xylostella is due to a change in a midgut membrane receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, p.5119-5123.
Gonzalez, J. M., Jr., and Carlton, B. C.（1980） Patterns of plasmid DNA in crystalliferous and acrystalliferous strains of Bacillus thuringiensis. Plasmid 3., p.92-98.
Giovanni, M. I.（1983）Response surface methodology on product optimization. Food technol., 11, p.41-45.
Gill, S. S., Cowles, E. A., and Pietrantonio, P. V.（1992）The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annu. Rev. Entomol., 37, p.615-636.
Glare, T. R., and O’Callaghan, M.（2000）Bacillus thuringiensis: biology, ecology and safety. John Wiley & Sons, West Sussex, UK. 350 pp.
Hofmann, C., Lhy, P., Hter, R., and Pliska, V.（1988）Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane vesicles of the cabbage butterfly（Pieris brassicae）. Eur. J. Biochem., 173, p.85-91.
Hofte, H., and Whiteley, H. R.（1989）Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Rev., 53, p.242-255.
Jogiekar, A. M. and May, A. T. （1987） Product excellence through design of experiments. Cereal food world., 32, p.857.
Khuri, A. I. and Cornell, J. A.（1987）Determining optimum conditions. 149-205. In: Response surface methodology. A. I. Khuri, and J. A. Cornell, eds. Marcel Dekker, New York.
Kalman, S., Kiehne, K. L., Libs, J. L., and Yamamoto, T.（1993）Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae. Appl. Environ. Microbiol., 59, p.1131-1137.
Kouskoura, T., Tickner, C., and Crickmore, N.（2001）Expression and crystallization of an N-terminally activated form of the Bacillus thuringiensis Cry1Ca toxin. Curr Microbiol., 43, p.371-373.
Kao, S. S., Hsieh, F. C., Tzeng, C. C., and Tsai, Y. S.（2003）Cloning and expression of the insecticidal crystal protein gene cry1Ca9 of Bacillus thuringiensis G10-01A from Taiwan granaries. Curr Microbiol., 47, p.295-299.
Li, J., Carroll, J., and Ellar, D. J.（1991）Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 angstroms resolution. Nature, 353, p.815-821.
Lereclus, D., Deleclus, A. and Lecadet, M. M.（1993）Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes. In P. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, and S. Higgs（ed.）Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, U.K., p.37-69.
Lorence, A., Darszon, A., Diaz, C., Lievano, A., Quintero, R., and Bravo, A.（1995）Delta-endotoxins induce cation channels in Spodoptera frugiperda brush border membranes in suspension and in planar lipid bilayers. FEBS Lett., 360, p.217-222.
Montgumery, D. C.（1976）Design and analysis of experiments. John Wiley & Sons. Inc., New York.
Meetus, A. M., and Macaluso, A.（1990） Expression of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin genes during vegetative growth. Appl. Environ. Microbiol., 56, p.1128-1134.
Mohan, M., and Gujar, G. T.（2001）Toxicity of Bacillus thuringiensis strains and commercial formulations to the diamondback moth, Plutella xylostella（L.）. Crop prot., 20, p.311-316.
Rammler, D. H., Gaertner, F. H., and Edwards, D. L.（1994） Pseudomonas hosts transformed with Bacillus endotoxin genes. USA patent no.5281532.
Rajamohan, F., Cotrill, J. A., Gould, F., and Dean, D. H.（1996）Role of domain II, loop 2 residues of Bacillus thuringiensis CryIAb delta-endotoxin in reversible and irreversible binding to Manduca sexta and Heliothis virescens. J. Biol. Chem., 271, p.2390-2396.
Schnepf, H. E., and Whiteley, H. R.（1981） Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, p.2893-2897.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. E.（1989） Molecular Cloning：A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
Schurter, W., Geiser, M., and Mathe, D.（1989） Efficient transformation of Bacillus thuringiensis and B. cereus via electroporation：transformation of acrystalliferous strains with a cloned delta-endotoxin gene. Mol. Gen. Genet., 218, p.177-181.
Soares, G. G., and Quick, T. C.（1992）MVP, a novel bioinsecticide for the control of diamondback moth, pp. 129-137. In: N. S. Talekar [ed.], Diamondback Moth and Other Crucifer Pests: Proceedings of the Second International Workshop. AVRDC publication no. 92-368, December 10-14, 1990, Asian Vegetable Research and Development Center, Taiwan, ROC.
Smith, G. P., and Ellar, D. J.（1994）Mutagenesis of two surface-exposed loops of the Bacillus thuringiensis CryIC δ-endotoxin affects insecticidal specificity. Biochem. J., 302, p.611-616.
Stevens, S. E., Jr., Murphy, R. C., Lamoreaux, W. J., and Coons, L. B.（1994）A genetically engineered mosquitocidal cyanobacterium. J. Appl. Phycol., 6, p.187-197.
Shin. B.-S., S.-H. Park, S.-K. Choi, B.-T. Koo, S.-T. Lee, and J.-I. Kim（1995）Distribution of cryV-type insecticidal protein genes in Bacillus thuringiensis and cloning of cryV-type genes from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and Bacillus thuringiensis subsp. entomosidus. Appl. Environ. Microbiol., 61, p.2402-2407.
Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D. R., and Dean, D. H.（1998）Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, p.775-806.
Thomson, D.（1982）Response surface experimentation. J. Food Proce. Preser., 6, p.155-188.
Tabashnik, B. E., Liu, Y. B., Malvar, T., Heckel, D. G., Masson, L., Ballester, V., Granero, F., Mensua, J. L. and Ferre, J.（1997）Global variation in the genetic and biochemical basis of diamondback moth resistance to Bacillus thuringiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, p.12780-12785.
Van Rie, J., Jansens, S., Degheele, D., and Van Mellaert, H.（1990）Receptors on the brush border membrane of the insect midgut as determinants of the specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. Appl. Environ. Microbiol., 56, p.1378-1385.
Yamamoto, T.（1990）Identification of entomocidal toxins of Bacillus thuringiensis by high-performance liquid chromatography. In: Hickle, L. A. and Fitch, W. L. [eds.], Analytical chemistry of Bacillus thuringiensis. American Chemical Society, Washington, D.C., p.46-60.
Yang, C. Y., Pang, J. C., Kao, S. S., and Tsen, H. Y.（2003）Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production. J. Agric. Food Chem., 51, p.100-105.