臺灣博碩士論文加值系統

己二烯二酸(Muconic acid, MA)是優良的特用化學品，可用於紫外線防護劑及軍警特用品；另在50 psi及室溫下以鉑當觸媒，即可將己二烯二酸轉換成己二酸(adipic acid)。己二酸為合成nylon 6,6的重要原料之一，其來源有化學合成法及微生物生產。以化工製程直接生產己二酸，除了苯環原料的使用會造成環境污染外，合成過程亦排放大量NOX等溫室氣體，進而造成溫室效應日益嚴重。若以微生物醱酵方式生產己二烯二酸(cis,cis-muconic acid)進而合成己二酸，發展乾淨無污染化工原料製程，則有助於降低環境污染。利用突變方式改變菌體代謝路徑，並搭配醱酵技術，提高菌體代謝產物的濃度，是微生物工程中常用的方法。本實驗以工業廢水中所分離得到的菌株，鑑定為Sphingobecterium sp.，搭配突變技術並建立菌體篩選策略，期以取得己二烯二酸之生產菌株。

原始菌株以葡萄糖及苯甲酸為碳源情況下具有MA生產能力，因此利用突變技術可誘使菌種變異，並發展成己二烯二酸累積生產菌株，再以本實驗所建立之目的菌株篩選策略，進行有效的篩選分離。實驗結果顯示，提供濃度5 g/l之葡萄糖碳源，以突變後所得菌株進行醱酵，可得MA濃度為50 mg/l，比較原始菌株相同條件下的生產能力(10 mg/l)，產量提升5倍左右。以苯甲酸為碳源情況下，給與變異株2 g/l之苯甲酸基質，經醱酵培養後產生MA濃度為1.23 g/l，比較原始菌株相同條件下的生產能力(0.1 g/l)，產量大幅提升10倍以上。在複合碳源醱酵實驗中得知，變異株編號M8110為琥珀酸之營養需求株(succinic acid-auxotroph)；於5升醱酵槽中，提供濃度皆為4 g/l之苯甲酸與琥珀酸複合碳源，經培養後可得MA濃度達3.4 g/l。

cis,cis-Muconic acid is an unsaturated dicarboxylic acid with six carbon atoms. This compound has been suggested to be potentially useful as a raw material for new functional resins, pharmaceuticals, and agricultural chemicals. It can easily be converted to adipic acid by hydrogenated at 50 psi for 3 h at room temperature. Adipic acid is an important compound, whose production is necessary for the manufacture of Nylon-6,6, which is product by chemical synthesis and microbial fermentation. Most industrial processes of adipic acid production use nitric acid oxidation of cyclohexanol, cyclohexanone, or both, which are accessible from benzene. An inevitable stoichiometric waste (N2O), which emitted from the nitric oxidation reaction, is commonly thought to cause global warming. Therefore, the development of environmentally procedure for the synthesis of adipic acid is highly important.
The experimental strain, Sphingobacterium sp, was isolated from the sewage of a styrene monomer manufacturing factory in Taiwan. The bacterium has potential for cis,cis-muconic acid production. It can consume benzoic acid or glucose to synthesize about 10 mg/l and 101 mg/l of cis,cis-muconic acid. Therefore, we develop the mutants from the wild type strains via mutagensis induced by NTG(N-methyl-N’ nitro-N-nitrosoguanidine) regent and UV irradiation, and then the mutant strains with high muconic acid productivity was selected by a series of screen methods. A Mutant M8110 which has over 10-fold increases in the yield of cis,cis-muconic acid compares with the wild type strain.

目錄

第一章 緒論…………………………………………………… 1
1.1 研究起緣與動機……………………………………… 1
1.2 研究目的……………………………………………… 11
第二章 文獻回顧……………………………………………… 14
第三章 實驗材料與方法……………………………………… 17
3.1 實驗藥品……………………………………………… 17
3.2 菌種來源與保存……………………………………… 18
3.2.1 實驗菌株…………………………………………… 18
3.2.2 菌種保存…………………………………………… 19
3.3 Sphingobacterium sp. 於不同碳源醱酵之探討……… 19
3.4 菌種突變試驗………………………………………… 22
3.4.1 化學突變劑NTG致死率試驗…………………… 22
3.4.2 物理突變UV致死率試驗………………………… 24
3.4.3 抗生素試驗………………………………………… 26
3.4.4 菌種突變篩選流程………………………………… 26
3.4.5 菌體濃度測定……………………………………… 32
3.4.6 UV-Vis分析………………………………………… 33
3.4.7 HPLC……………………………………………… 34
3.5 變異株純化與單離…………………………………… 36
3.6 變異株生產己二烯二酸能力之探討………………… 36
3.6.1 不同苯甲酸濃度對變異株生產己二烯二酸能力 之探討……………………………………………… 36
3.6.2 不同琥珀酸濃度對變異株生產己二烯二酸能力
之探討……………………………………………… 38
第四章 結果與討論…………………………………………… 39
4.1 Sphingobacterium sp.之生長特性……………………… 39
4.1.1 葡萄糖碳源對Sphingobacterium sp.醱酵之探討… 39
4.1.2 苯甲酸碳源對Sphingobacterium sp.醱酵之探討… 43
4.1.3 複合碳源對Sphingobaterium sp.醱酵之探討…… 46
4.2 突變劑對Sphingobaterium sp.之影響………………… 49
4.2.1 NTG致死能力……………………………………… 49
4.2.2 UV致死能力……………………………………… 49
4.3 抗生素對Sphingobacterium sp.抑制能力……………… 50
4.4 菌種突變與篩選結果…………………………………… 51
4.4.1 菌種以葡萄糖為碳源之突變篩選結果…………… 51
4.4.2 菌種以苯甲酸為碳源之突變篩選結果…………… 54
4.5 變異株M8單離與純化………………………………… 58
4.6 變異菌M8110之生長特性…………………………… 61
4.6.1 不同苯甲酸與琥珀酸比例複合碳源之影響 …… 61
4.6.2 M8110於5升醱酵槽醱酵生產己二烯二酸之探討 69
第五章 結論…………………………………………………… 71
第六章 未來方向……………………………………………… 73
第七章 參考文獻……………………………………………… 74
附錄一 實驗儀器……………………………………………… 77
附錄二 Sphingobacterium sp. 鑑定報告……………………… 78











表目錄

表1-1 近年Nylon塑膠全球主要地區產能及供需情形推估… 1
表1-2 己二酸之結構與化學性質……………………………… 2
表1-3 近年來亞洲地區己二酸進出口情況…………………… 11
表3-1 實驗藥品一覽…………………………………………… 17
表3-2 菌體活化前培養成份…………………………………… 20
表3-3 不同苯甲酸濃度培養基………………………………… 20
表3-4 不同葡萄糖濃度培養基………………………………… 21
表3-5 不同苯甲酸複合碳源培養基…………………………… 21
表3-6 致死率試驗培養基成份………………………………… 25
表3-7 抗生素(PC)濃度與劑量………………………………… 26
表3-8 菌種以葡萄糖為碳源之突變篩選培養基……………… 30
表3-9 菌種以苯甲酸為碳源之突變篩選培養基……………… 31
表3-10 不同濃度苯甲酸之培養基…………………………… 37
表3-11 不同濃度琥珀酸之培養基…………………………… 38
表4-1 不同葡萄糖濃度產物生成量比較……………………… 39
表4-2 不同苯甲酸濃度之產物生成比較……………………… 42
表4-3 菌種以苯甲酸為碳源之突變篩選菌與產量關係……… 56
表4-4 變異株M8單離純化結果……………………………… 58
表4-5 變異株M8110單離純化結果…………………………… 59
表4-6 變異株M8110二次單離純化結果……………………… 60
表4-7 M8110於不同複合碳源濃度產物生成比較…………… 68
















圖目錄

圖1-1 己二酸之化工製程……………………………………… 3
圖1-2 微生物消耗葡萄糖生產己二烯二酸之代謝路徑……… 5
圖1-3 BMP之代謝路徑產物及酵素………………………… 6
圖1-4 己二烯二酸之三種結構型態…………………………… 7
圖1-5 菌種突變篩選流程……………………………………… 7
圖1-6 UV突變造成之嘧啶二聚體結構……………………… 9
圖1-7 烷化劑NTG對DNA之反應位置…………………… 10
圖1-8 突變劑NTG之結構…………………………………… 10
圖1-9 突變劑EMS之結構…………………………………… 10
圖3-1 NTG致死率試驗流程………………………………… 23
圖3-2 UV致死率試驗流程…………………………………… 24
圖3-3 轉印培養法示意圖…………………………………… 28
圖3-4 點對照法示意圖……………………………………… 28
圖3-5 突變分析流程………………………………………… 29
圖3-6 菌體量(DCW)與吸收值(OD)關係圖………………… 32
圖3-7 己二烯二酸標準品溶於甲醇之UV光譜…………… 33
圖3-8 苯甲酸標準品溶於甲醇之UV光譜………………… 34
圖3-9 己二烯二酸、鄰苯二酚與苯甲酸標準品之HPLC圖譜 35
圖3-10 單離純化流程………………………………………… 37
圖 4-1 Sphingobacterium sp.於不同葡萄糖濃度菌體生成
比較………………………………………………… 40
圖 4-2 Sphingobacterium sp.於不同葡萄糖濃度消耗速率
對己二烯二酸生產比較……………………………… 41
圖4-3 Sphingobacterium sp.於不同苯甲酸濃度生長比較… 43
圖 4-4 Sphingobacterium sp.於不同苯甲酸濃度對己二烯二酸
生產比較……………………………………………… 44
圖4-5 Sphingobacterium sp.於不同複合碳源生長比較…… 46
圖 4-6 Sphingobacterium sp.於不同複合碳源之己二烯二酸
產量比較………………………………………… 47
圖 4-7 Sphingobacterium sp.於不同複合碳源苯甲酸消耗能力 48
圖4-8 NTG反應時間與致死率…………………………… 49
圖4-9 UV照射時間與致死率……………………………… 49
圖4-10 不同抗生素濃度對Sphingobacterium sp.抑制能力… 50
圖4-11 原始菌株以葡萄糖為碳源，經UV突變後篩選菌體
數與己二烯二酸濃度關係圖………………………… 52
圖4-12 原始菌株以葡萄糖為碳源，UV二次突變篩選菌體
數與己二烯二酸濃度關係圖………………………… 52
圖4-13 原始菌株以葡萄糖為碳源，經NTG突變篩選菌體
數與己二烯二酸濃度關係圖………………………… 53
圖4-14 原始菌株以葡萄糖為碳源，NTG二次突變篩選菌體
數與己二烯二酸濃度關係圖………………………… 53
圖4-15 突變菌種篩選流程…………………………………… 55
圖4-16 變異株M8之生長曲線……………………………… 57
圖4-17 M8110於苯甲酸(2 g/l)與琥珀酸(2 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 62
圖4-18 M8110於苯甲酸(2 g/l)與琥珀酸(4 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 63
圖4-19 M8110於苯甲酸(4 g/l)與琥珀酸(2 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 64
圖4-20 M8110於苯甲酸(4 g/l)與琥珀酸(4 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 65
圖4-21 M8110於苯甲酸(8 g/l)與琥珀酸(4 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 66
圖4-22 M8110於苯甲酸(16 g/l)與琥珀酸(4 g/l)複合碳源之生
長曲線……………………………………………… 67
圖4-23 M8110於5升醱酵槽之生長曲線………………… 70

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