臺灣博碩士論文加值系統

本文係研究新型STREAMLINE Direct HST樹脂，利用牛血清蛋白和溶菌酶的吸附與脫附行為來建立樹脂的吸附模式，實驗內容包括吸附pH值的選擇、離子強度與疏水特性對吸附及脫附程序影響。實驗結果可用來建立HST樹脂對蛋白質的物理和化學吸附吸附行為。接著應用攪拌式流體化床與STREAMLINE Direct HST 樹脂將未稀釋的雞蛋白溶液進行溶菌酶的直接回收程序。為了獲得最佳的溶菌酶操作條件其相關實驗包括(1)流體化試驗，(2)攪拌速度和液體黏度在流體化床膨脹高度和穩定關係，(3)吸附pH值選擇，(4)離子強度的與疏水特性對吸附及脫附程序影響，(5)動相鍵結量與沖提條件的選擇。結果顯示使用0.5 M 氯化鈉鹽類溶液在40 mM的碳酸鈉緩衝溶液(pH 12)當沖提溶液可一步驟的純化非澄清雞蛋白，其純度提昇15.72倍而回收率達94.30%。

In this work, the new type of STREAMLINE Direct HST adsorbent was used to investigate the adsorption and desorption behavior of bovine serum albumin (BSA) and lysozyme as model proteins. The experiments included the choice of adsorption pH, the effects of ionic strength and hydrophobicity on the adsorption processes. The results could be used to construct the physical and chemical properties of the HST adsorbent for protein adsorption. Furthermore, the HST adsorbent was employed to directly recover the lysozyme from unclarified fresh chicken egg white (CEW) by using stirred fluidized bed technique. In order to obtain optimal conditions for the direct recovery of lysozyme, the related experiments included (1) the relationship fluidized between operating liquids, (2) the effect of shaking rate and liquid viscosity on the degree of expansion and stability of the fluidized bed, (3) the choice of adsorption pH, (4) the effect of ionic strength and hydrophobicity on the adsorption and desorption processes, and (5) the effect of shaking rate on the dynamic binding capacity. The results showed that lysozyme was directly recovered using 0.5 M NaCl in 40 mM sodium carbonate buffer (pH 12) from unclarified CEW with a purification factor of 15.72 and yield of 94.30% in a single step.

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明志科技大學碩士學位論文口試委員審定書 ii
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誌謝 iv
中文摘要 v
英文摘要 vi
目錄 vii
圖目錄 xii
表目錄 xvi
縮寫對照表 xvii
符號表 xviii
一. 緒論 1
二. 文獻回顧 3
1. 管柱層析法發展 3
1.1. 填充床管柱層析法 3
1.2. 流體化床管柱層析法 4
1.3. 膨脹床管柱層析法 5
1.4 攪拌式流體化床管柱層析法 7
2. 吸附劑的選擇 11
2.1. 離子交換樹脂 12
2.2. 疏水性樹脂 13
2.3. 親和性樹脂 13
2.4. 固定化金屬螫合親合性樹脂 13
2.5. 複合型樹脂 13
3. 蛋白質特性介紹 15
3.1. 牛血清蛋白 15
3.2. 溶菌酶 15
3.3. 雞蛋白 17
4. 樹脂吸附行為之探討 19
4.1. 蛋白質表面帶電特性 19
4.2. Henderson-Hasselbalch方程式 19
4.3. 熱力學等溫吸附曲線 20
4.4. Langmuir等溫吸附模式 20
4.5. 動力學吸附速率模式 21
三. 實驗方法與材料 23
1. 牛血清蛋白吸附行為研究 23
1.1. 實驗材料 23
1.1.1. 實驗藥品 23
1.1.2. 實驗設備 23
1.1.3. 緩衝溶液之製備 24
1.2. 樹脂對牛血清蛋白吸附行為探討 24
1.2.1. STREAMLINE Direct HST樹脂滴定曲線 24
1.2.2. 總量蛋白質標準直線方程式 25
1.2.3. 樹脂對牛血清蛋白吸附最適操作條件之選擇 25
1.2.4. 樹脂對牛血清蛋白等溫吸附行為探討 27
1.2.5. 樹脂對牛血清蛋白吸附速率探討 28
1.2.6. 樹脂對牛血清蛋白沖提條件的選擇 29
2. 溶菌酶吸附行為研究 30
2.1. 實驗材料 30
2.1.1. 實驗藥品 30
2.1.2. 實驗設備 30
2.2. 樹脂對溶菌酶吸附行為探討 31
2.2.1. 總量蛋白質標準直線方程式 31
2.2.2. 樹脂對溶菌酶吸附最適操作條件之選擇 31
2.2.3. 樹脂對溶菌酶等溫吸附行為探討 32
2.2.4. 樹脂對溶菌酶吸附速率探討 32
2.2.5. 樹脂對溶菌酶沖提條件的選擇 33
3. 從新鮮雞蛋白溶液中純化溶菌酶 34
3.1. 實驗材料 34
3.1.1. 實驗藥品 34
3.1.2. 實驗設備 35
3.1.3. 溶液製備 36
3.2. 樹脂對新鮮雞蛋白中溶菌酶吸附行為探討 36
3.2.1. 雞蛋白中溶菌酶活性測試 36
3.2.2. 樹脂對雞蛋白中溶菌酶最適操作條件之選擇 37
3.2.3. 樹脂對雞蛋白中溶菌酶沖提條件之選擇 38
3.3. 流體化試驗 38
3.4. 突破曲線 39
3.5. 從新鮮雞蛋白中純化溶菌酶之直接回收程序 40
3.6. SDS-PAGE電泳分析 40
四. 結果與討論 42
1. 牛血清蛋白吸附行為研究 42
1.1. 樹脂吸附牛血清蛋白之最適pH值 42
1.2. 離子強度對樹脂吸附牛血清蛋白能力之影響 44
1.2.1. 緩衝溶液離子強度之影響 45
1.2.2. 氯化納及硫酸銨鹽類溶液之影響 45
1.3. 醇類有機物質對樹脂吸附牛血清蛋白能力之影響 48
1.4. 樹脂對牛血清蛋白等溫吸附行為之探討 50
1.5. 樹脂對牛血清蛋白吸附速率探討 54
1.6. 樹脂對牛血清蛋白沖提條件之選擇 56
1.6.1. pH值效應 56
1.6.2. 氯化鈉鹽類之效應 57
1.6.3. pH與氯化鈉鹽類之共同效應 58
1.6.4. 沖提速度之效應 59
1.6.5. 沖提體積之效應 60
2. 溶菌酶吸附行為研究 61
2.1. 樹脂吸附溶菌酶最適pH值之選擇 61
2.2. 離子強度對樹脂吸附溶菌酶能力之影響 62
2.2.1. 緩衝溶液離子強度之影響 62
2.2.2. 氯化納及硫酸銨鹽類溶液之影響 63
2.3. 醇類有機物質對樹脂吸附溶菌酶能力之影響 65
2.4. 樹脂對溶菌酶等溫吸附行為之探討 67
2.5. 樹脂對溶菌酶吸附速率探討 69
2.6. 樹脂對溶菌酶沖提條件之選擇 70
2.6.1. pH值效應 71
2.6.2. 沖提速度之效應 72
2.6.3. 沖提體積之效應 73
2.6.4. 預測最佳之吸附與脫附條件 74
3. 從新鮮雞蛋白溶液中純化溶菌酶 75
3.1. 樹脂吸附雞蛋白中溶菌酶最適pH值之選擇 75
3.2. 離子強度對樹脂吸附雞蛋白中溶菌酶之影響 76
3.2.1. 緩衝溶液離子強度之影響 76
3.2.2. 氯化納鹽類溶液之影響 77
3.3. 醇類有機物質對樹脂吸附雞蛋白中溶菌酶之影響 78
3.4. 樹脂對雞蛋白中溶菌酶沖提條件的選擇 79
3.5. 流體化試驗 81
3.6. 突破曲線 82
3.7. 新鮮雞蛋白中溶菌酶直接回收程序 86
3.8. SDS-PAGE電泳分析 87
3.9. 溶菌酶純化程序之比較 88
五. 結論與展望 90
六. 參考文獻 91

圖目錄
圖2-1. (A)填充床；(B)流體化床；(C)膨脹床層析管柱比較圖 4
圖2-2. 膨脹床管柱操作流程圖 5
圖2-3. UpFront EBA 管柱 8
圖2-4. Amershanm Biosciences STREAMLINE Direct管柱 8
圖2-5. 攪拌式流體化床層析管柱 10
圖2-6. STREAMLINE Direct HST 樹脂結構圖 14
圖2-7. 溶菌酶一級結構圖 16
圖2-8. 雞蛋結構圖 17
圖3-1. 循回式批次吸附程序示意圖 26
圖3-2. 循回式填充床吸附程序示意圖 27
圖3-3. 填充床吸附程序示意圖 37
圖3-4. 攪拌式流體化床吸附程序示意圖 39
圖4-1. HST樹脂酸鹼滴定圖 43
圖4-2. 不同pH值的HST樹脂對牛血清蛋白吸附量比較圖 44
圖4-3. HST樹脂在不同濃度的10 mM醋酸鈉緩衝溶液(pH 4.5)對牛血清蛋白的吸附量比較 45
圖4-4. HST樹脂在不同鹽類濃度的10 mM醋酸鈉緩衝溶液(pH 4.5)對牛血清蛋白的吸附量之比較 46
圖4-5. HST樹脂在1 M硫酸銨緩衝溶液(pH 4-9)對牛血清蛋白的吸附量之比較 47
圖4-6. HST樹脂在不同硫酸銨濃度的20 mM醋酸鈉緩衝溶液(pH 4.5)對牛血清蛋白的吸附量之比較 48
圖4-7. HST樹脂在20mM緩衝溶液(30%乙二醇，pH4-12)對牛血清蛋白吸附量之比較 49
圖4-8. HST樹脂在不同乙二醇濃度的20 mM醋酸鈉緩衝溶液(pH 4.5)對牛血清蛋白的吸附量之比較 50
圖4-9. HST樹脂對不同條件的濃度系統牛血清蛋白等溫吸附曲線(批次法) 51
圖4-10. HST樹脂對不同條件的牛血清蛋白的等溫吸附曲線(填充床法) 51
圖4-11. HST樹脂對不同條件系統牛血清蛋白的等溫吸附線性關係(批次法) 52
圖4-12. HST樹脂對不同條件系統牛血清蛋白的等溫吸附線性關係(填充床法) 52
圖4-13. HST樹脂對不同鹽類系統牛血清蛋白的吸附速率曲線 55
圖4-14. HST樹脂對不同黏度系統牛血清蛋白的吸附速率曲線 56
圖4-15. 不同pH值緩衝溶液對牛血清蛋白的脫附累積百分率之比較 57
圖4-16. 不同鹽類濃度/pH值緩衝溶液對牛血清蛋白的脫附累積百分率之比較 58
圖4-17. 不同鹽類濃度10 mM磷酸鈉緩衝溶液(pH 7)對牛血清蛋白的脫附累積百分率之比較 59
圖4-18. 不同緩衝溶液在不同流速對牛血清蛋白的脫附累積百分率之比較 60
圖4-19. 不同緩衝溶液在不同沖提體積對牛血清蛋白的脫附累積百分率之比較 61
圖4-20. 不同pH值的HST樹脂對溶菌酶吸附量比較圖 62
圖4-21. HST樹脂在不同濃度的甘胺酸緩衝溶液(pH 9)對溶菌酶的吸附量比較 63
圖4-22. HST樹脂在不同鹽類濃度的20 mM甘胺酸緩衝溶液(pH 9)對溶菌酶的吸附量之比較 64

圖4-23. SP樹脂在不同鹽類濃度的20 mM甘銨酸鈉緩衝溶液(pH 9)對溶菌酶的吸附量之比較 64
圖4-24. HST樹脂在1 M硫酸銨緩衝溶液(pH 4-9)對溶菌酶的吸附量之比較 65
圖4-25. HST樹脂在30%乙二醇緩衝溶液(pH 4-12)對溶菌酶的吸附量之比較 66
圖4-26. HST樹脂在不同乙二醇濃度的20 mM甘胺酸緩衝溶液(pH 9)對溶菌酶的吸附量之比較 67
圖4-27. HST樹脂對不同條件的濃度系統溶菌酶等溫吸附曲線(批次法) 68
圖4-28. HST樹脂對不同條件系統的溶菌酶等溫吸附線性關係(批次法) 68
圖4-29. HST樹脂對不同條件系統溶菌酶的吸附速率曲線(批次法) 70
圖4-30. 不同pH值緩衝溶液對吸附溶菌酶的脫附累積百分率之比較 71
圖4-31. 不同pH值(10-12)緩衝溶液對吸附溶菌酶的脫附累積百分率之比較 72
圖4-32. 不同流速對溶菌酶的脫附百分率之比較 73
圖4-33. 改變沖提體積對溶菌酶的脫附百分率之比較 74
圖4-34. 不同pH值的HST樹脂對雞蛋白中溶菌酶吸附量比較 75
圖4-35. HST樹脂在不同濃度的甘胺酸緩衝溶液(pH 10)對雞蛋白中溶菌酶的吸附量比較 76
圖4-36. HST樹脂在不同鹽類濃度的10 mM甘胺酸緩衝溶液(pH 10)對雞蛋白中溶菌酶的吸附量比較 77
圖4-37. HST樹脂在30%乙二醇緩衝溶液(pH 4-12)對雞蛋白中溶菌酶的吸附活性之比較 78
圖4-38. HST樹脂在不同乙二醇濃度的10 mM甘胺酸緩衝溶液(pH 10)對雞蛋白中溶菌酶的吸附活性之比較 79
圖4-39. 不同操作條件碳酸鈉緩衝溶液(pH 12)雞蛋白中對溶菌酶的脫附百分率之比較 80
圖4-40. 不同操作條件碳酸鈉緩衝溶液(pH 12) 對雞蛋白中溶菌酶的脫附百分率之比較 81
圖4-41. 不同操作條件對HST樹脂之管柱流體化高度的影響比較 82
圖4-42. HST樹脂在攪拌轉速(0 rpm)對雞蛋白中溶菌酶活性及一般蛋白質突破曲線 83
圖4-43. HST樹脂在攪拌轉速(100 rpm)對雞蛋白中溶菌酶活性及一般蛋白質突破曲線 83
圖4-44. HST樹脂在攪拌轉速(150 rpm)對雞蛋白中溶菌酶活性及一般蛋白質突破曲線 84
圖4-45. HST樹脂在攪拌轉速(200 rpm)對雞蛋白中溶菌酶活性及一般蛋白質突破曲線 84
圖4-46. HST樹脂在不同攪拌轉速對雞蛋白溶菌酶活性突破曲線 85
圖4-47. HST樹脂在不同攪拌轉速對雞蛋白一般蛋白質突破曲線 85
圖4-48. 攪拌式流體化床純化各階段表現譜圖 87
圖4-49. 溶菌酶純化程序SDS-PAGE表現圖 88

表目錄
表2-1. 膨脹床層析管柱樹脂特性比較 6
表2-2. STREAMLINE SP與STREAMLINE Direct HST樹脂
特性之比較 12
表2-3. 牛血清蛋白中的胺基酸組成 15
表2-4. 不同來源溶菌酶之胺基酸組成 16
表2-5. 雞蛋白組成份與特性 18
表3-1. 不同濃度的SDS-聚丙烯醯胺凝膠配製表 41
表4-1. HST樹脂對牛血清蛋白平衡熱力學參數表 54
表4-2. 牛血清蛋白平衡熱力學與動力學參數（批次法） 55
表4-3. HST樹脂對牛血清蛋白與溶菌酶批次法平衡熱力學參數比較表 69
表4-4. 溶菌酶平衡熱力學與動力學參數 70
表4-5. 甘油與雞蛋白密度及黏度之比較表 82
表4-6. 攪拌式流體化床純化程序之表現 86
表4-7. 溶菌酶純化程序之比較 89

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