跳到主要內容

臺灣博碩士論文加值系統

(44.222.218.145) 您好!臺灣時間:2024/02/26 23:06
字體大小: 字級放大   字級縮小   預設字形  
回查詢結果 :::

詳目顯示

: 
twitterline
研究生:洪照先
研究生(外文):Jaw-Shian Hung
論文名稱:人類肝細胞株HepG2及昆蟲細胞株Sf9嘌呤5'-核苷酸酶的特性分析
論文名稱(外文):Characterization of purine 5'-nucleotidase from Hep G2 and Sf9
指導教授:曾惠芬曾惠芬引用關係
指導教授(外文):Huey-Fen Tzeng
學位類別:碩士
校院名稱:國立暨南國際大學
系所名稱:應用化學系
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:51
中文關鍵詞:5’-核苷酸酶
外文關鍵詞:5’-nucleotidase
相關次數:
  • 被引用被引用:1
  • 點閱點閱:176
  • 評分評分:
  • 下載下載:20
  • 收藏至我的研究室書目清單書目收藏:0
5’-核苷酸酶 (5’-nucleotidase, 5’-NT) 可調節在各組織器官中具各種生理活性的核苷、核苷酸和前兩者之類似物的濃度,維持體內核酸代謝的平衡,故為一種重要的磷酸酯水解酶。傳統分析核苷酸代謝酵素活性的方法相當麻煩,且所須的樣品量較多。本研究是利用毛細管區帶電泳分離核苷與核苷酸,以開發非放射性的5’-NT活性分析法,進而比較人類肝癌細胞Hep G2以及昆蟲細胞Sf9中的5’-NT的特性。在5’-NT活性分析實驗中,我們只須6分鐘就能有效分離標準品。另外加入乙腈和氯化鈉至樣品溶液中可以達到樣品堆積的效果。在此毛細管區帶電泳法中,Ado、hXan及I檢量線之相關係數分別為0.9998、0.9997和0.9993,而偵測極限分別為2.49 M、2.79M和4.36 M。於再現性試驗中,Ado、hXan及I和內標準品面積比再現性的相對標準偏差皆小於7.47 %,滯留時間的相對標準偏差皆小於1.60 %。利用此方法可以分析細胞內與AMP代謝相關的5’-NT活性特性。初步的結果顯示,人類肝癌細胞Hep G2及昆蟲細胞Sf9內5’-NT的最初反應速率與濃度的關係皆是Hill方程式的模式,即表示AMP與該酵素的反應可能有受異位調控因子的影響。人類肝癌細胞Hep G2的5’-NT對AMP有較好的親和力,而昆蟲細胞Sf9的5’-NT則有較大的最大反應速率。
The 5’-nucleotidaes (5’-NT) are involved in the regulation different physiological activation of nucleosides, nucleotides, and their analogues in organs. Therefore 5’-NT maintains balanced nucleotide pools, so it is one of the important phosphohydrolases. The traditional enzyme assays of 5’-NT are quite complicated, and need more sample. In order to develop non-radioactive assays to characterize the 5’-NTs from Hep G2 and Sf9, adenosine, hypoxanthine, inosine and AMP were separated by capillary zone electrophoresis. For the assay of 5’-NT, the standards were effectively separated in only 6 minutes. Addition of acetonitrile and sodium chloride to sample buffer could enhance sample stacking. The correlation coefficient of Ado、hXan and I were 0.9998, 0.9997, and 0.9993, respectively. The concentration limits of detection of Ado、hXan and I were 2.49 M、2.79M and 4.36 M, respectively. In the precision test, all relative standard deviations of migration time and area ratio were smaller than 1.60 % and 7.47 %, respectively. This method was applied to characterize the 5’-NT related to AMP metabolism. The kinetics of the 5'-NTs from Hep G2 and Sf9 followed Hill equation. It suggested that these 5’-NTs were regulated by allosteric effectors. The 5’-NT from Hep G2 showed higher affinity to AMP compared to that from Sf9; however, the latter showed a larger maximum velocity than the former.
目錄

中文摘要 I
英文摘要 III
目錄 V
圖目錄 VII
表目錄 VIII

第一章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 5’-核苷酸酶及腺苷簡介 1
1.2.1 5’-核苷酸酶重要性 1
1.2.2 腺苷重要性 3
1.2.3 過去分析方法 4
1.2.3.1 放射性同位素方法 4
1.2.3.2 光譜儀測量方法 5
1.2.3.3 HPLC方法 5
1.3 毛細管電泳簡介 6
1.3.1 毛細管泳技術的發展歷程 6
1.3.2 毛細管電泳基本構造 6
1.3.3 毛細管電泳分離原理 7
1.3.4 影響毛細管電泳分離效率的因素 9
1.3.4.1 緩衝溶液的選擇 9
1.3.4.2 分離電壓 11
1.3.4.3 毛細管的尺寸 11
1.3.4.4 溫度 13
1.3.4.5 添加劑 13
1.3.5 毛細管電泳的偵測方式 13
1.3.6 樣品前濃縮 15
1.4 酵素動力學簡介 17
1.4.1 Michaelis-Menten動力學方程式 17
1.4.2 Hill方程式 20
1.5 研究動機與目的 23
第二章 材料與方法 24
2.1 材料與設備 24
2.1.1 化學試劑 24
2.1.2 細胞來源 25
2.1.3 儀器設備 26
2.2 實驗方法 27
2.2.1 蛋白質之定量 27
2.2.2 酵素活性分析 28
2.2.3 酵素分析樣品的配置 29
2.2.4 毛細管處理 30
2.2.5 校正曲線的建立 30
第三章 5’-核苷酸酶活性分析之結果與討論 31
3.1 最佳分析條件 31
3.2 檢量線及再現性試驗 36
3.2.1 檢量線 36
3.2.2 再現性試驗 38
3.3 酵素活性分析的應用 39
3.3.1 真實樣品分析 39
3.3.2 與其他5’-NT活性分析之比較 43
3.4 Hep G2及Sf9 酵素動力學 43
第四章 結論 47
參考文獻 48


圖目錄

圖1.1 腺苷單磷酸的分解代謝圖 2
圖1.2 受質濃度[S]對最初酵素催化反應速度的影響 18
圖1.3 以Lineweaver-Burk雙倒數線性關係式計算動力學常數
Km和Vmax 19
圖1.4 “S”型飽和動力學 20
圖2.1 毛細管電泳儀簡圖 27
圖2.2 Hep G2活性分析樣品與分析標準品的配置流程圖 29
圖3.1 無添加乙腈最佳條件分析標準品之電泳圖 33
圖3.2 最佳條件分析標準品之電泳圖 35
圖3.3 (a) Adenosine、(b) Hypoxanthine、(c) Inosine檢量線 37
圖3.4 真實樣品分析電泳圖。Hep G2的5’-NT催化AMP去磷酸化
反應 41
圖3.5 [AMP]對5’-NT源自 (A) Hep G2與 (B) Sf9的催化反應速度
飽和曲線圖 44

表目錄

表1.1 常用的CE緩衝液及其pKa值和有效pH值範圍 10
表1.2 各種不同內徑毛細管 (長度固定為50 cm) 其表面積與體積比 (Surface-To-Volume Ratio) 之比較 12
表1.3 毛細管電泳中常見的添加劑及其作用 14
表1.4 受質及結合位相互關係之比較 22
表3.1 Ado、hXan及I各濃度訊號面積/I.S訊號面積比和遷移時間
之RSD值 38
表3.2 Ado、hXan及I Day to Day再現性試驗 39
表3.3 真實樣品分析之生成物Ado、hXan及I濃度數據 42
表3.4 Hep G2、Sf9內5’-NT的特性差異 45
參考文獻

1.S.A. Hunsucker, B.S. Mitchell, J. Spychala, Phamacol. Ther. 107 (2005) 1.
2.Y. Moriwaki, T. Yamamoto, K. Higashino, Histol. Histopathol., 14 (1999) 1321.
3.郭婧婧、彭贵华、武四云, 中國醫學工程, 14 (2006) 71.
4.A.N. Drury, A. Szent-Gyorgyi, J. Physiol. Lond., 68 (1929) 213.
5.T.V. Dunwiddie, S.A. Masino, Annu. Rev. Neurosci., 24 (2001) 31.
6.林佳慧,「一氧化碳、腺苷及麩氨酸在大鼠孤立束核內心臟血管作用之研究」,碩士論文,國立中山大學生物醫學科學研究所,高雄 (2002)。
7.R.M. Berne, R. Rubio, R.R. Curnish, Circ. Res., 35 (1974) 262.
8.J. Avruch, D.F. Wallach, Biochim. Biophys. Acta, 233 (1971) 334.
9.C. Ip, T. Dao, Cancer Res., 38 (1978) 723.
10.N.L. Edwards, D.B. Magilavy, J.T. Cassidy, I.H. Fox, Science, 201 (1978) 628.
11.J.P van Laarhoven, G.T. Spierenburg, C.H de Bruyn, J. Immunol. Methods, 39 (1980) 47.
12.C.H. Fiske, Y. Subbarow, J. Biol. Chem., 66 (1925) 375.
13.P.S Chen, Jr., T.Y. Toribara, H. Warner, Anal. Chem., 28 (1956) 1756.
14.C.C. Widnell, Methods Enzymol., 32 (1974) 368.
15.R.A. Hartwick, S.P. Assenza, P.R. Brown, J. Chromatogr., 186 (1979) 647.
16.J.N. Stolk, R.A. de Abreu, A.M. Boerbooms, D.G. de Koning, R. de Graaf, P.J. Kerstens, L.B. van de Putte, J. Chromatogr. B Biomed. Appl., 666 (1995) 33.
17.A. Tiselius, Trans. Faraday Soc., 33 (1937) 524.

18.李建武、蕭能 、余瑞元、陳麗蓉、陳雅蕙、陳來同、袁明秀,「生物化學實驗原理和方法」,藝軒圖書出版社,台北市,第114-117頁 (1999)。
19.R. Kuhn, S. Hoffstetter- Kuhn. Capillary Electrophoresis: Principle and practice. CRC, London. (1993).
20.J.W. Jorgenson, K.D. Lukacs, Anal. Chem., 53 (1981) 1298.
21.J.W. Jorgenson, K.D. Lukacs, J. Chromatogr., 281 (1981) 209.
22.S.F.Y. Li, Capillary Electrophoresis: Principle and Application, Elsevier, Amsterdam. (1992).
23.J.P. Landers, Handbook of Capillary Electrophoresis, 2nd ed., CRC Press, New York, USA (1997)
24.G. Ewing, R.A. Wallingford, T.M. Clefirowicz, Anal. Chem., 61 (1989) 292A.
25.K.D. Battle, P. Myers, J. Chromatogr. A, 916 (2001) 3.
26.J.L. Beckers and P. Bocek, Electrophoresis, 24 (2003) 518.
27.S.E. Geldart, P.R. Brown, J. Chromatogr. A, 828 (1998) 317.
28.S.E. Geldart, P.R. Brown, J. Chromatogr. A, 792 (1997) 67.
29.M. Huang, S. Liu, B.K. Murray, M.L. Lee, Anal. Biochem., 207 (1992) 231.
30.D.L.D. Deforce, F.P.K. Ryniers, E. Van den Eekhout, Anal. Chem., 68 (1996) 3575.
31.S.E. Geldart, P.R. Brown, J. Microcol. Sep., 10 (1998) 65.
32.A. Loregian, C. Scremin, M. Schiavon, A. Marcello, G. Palu, Anal. Chem., 66 (1992) 1682.
33.J.A. Taylor and E.S. Yeung, J. Chromatogr., 550 (1991) 831.
34.J.P. Chervet, R.E.J. van Soest and M. Ursem, J. Chromatogr., 543 (1991) 439.
35.A. Hiraoka, J. Akai, I. Tominaga, M. Hattori, H. Sasaki and T. Arato, J. Chromatogr. A, 680 (1994) 243.
36.S.Y. Liao, Y.C. Chao, C.W. Whang, J. High Res. Chromatogr., 18 (1995) 667.
37.S.Y. Liao, C.W. Whang, J. Chromatogr. A, 736 (1996) 247.
38.C.J. Alexander, M.M. Richter, Anal. Chim. Acta, 402 (1999) 105.
39.A. Arora, J.C.T. Eijkel, W.E. Morf, A. Manz, Anal. Chem., 73 (2001) 3282.
40.C.W. Whang, I.C. Chen, Anal. Chem., 64 (1992) 2461.
41.A.G. Ewing, J.M. Mesaros, P.F. Gavin, Anal. Chem., 66 (1994) 527A.
42.W. Li, A. Moussa, R.W. Giese, J. Chromatogr., 608 (1992) 171.
43.H.C. Tseng, R. Dadoo, R.N. Zare, Anal. Biochem., 222 (1994) 55.
44.W.G. Kuhr, E.S. Yeung, Anal. Chem., 60 (1988) 2642.
45.R.E. Milofsky, E.S. Yeung, Anal. Chem., 65 (1993) 153.
46.S.M. Wolf, P. Vouros, Anal. Chem., 67 (1995) 891.
47.A.F. Lecoq, S. di Biase, L. Montanarella, J. Chromatogr., 638 (1993) 363.
48.Z. Zhao, J.H. Wahl, H.R. Udseth, S.A. Hofstadler, A.F. Fuciarelli, R.D. Smith, Electrophoresis, 16 (1995) 389.
49.H. Lin, D.K. Xu, H.Y. Chen, J. Chromatogr. A, 760 (1997) 227.
50.G. Hempel, Electrophoresis, 21 (2000) 691.
51.Z.K. Shihabi, J. Chromatogr. A, 807 (1998) 27.
52.Z.K. Shihabi, J. Chromatogr. A, 744 (1996) 231.
53.Z.K. Shihabi, J. Chromatogr. A, 902 (2000) 107.
54.F. Tagliaro, G. Manetto, F. Crivellente, D. Scarcella, M. Marigo, Forens. Sci. Int., 92 (1998) 201.
55.A.B. Wey, C.-X. Zhang, W. Thormann, J. Chromatogr. A, 853 (1999) 95.
56.R.-L. Chien, D.S. Burgi, Anal. Chem., 64 (1992) 1046.
57.G. McGrath, W.F. Smyth, J. Chromatogr. B, 681 (1996) 125.

58.G.B. Harland, G. McGrath, S. McClean, W.F. Smyth, Anal. Commun. 34 (1997) 9.
59.M.E. Hadwiger, S.R. Torchia, S. Park, M.E. Biggin, C.E. Lunte, J. Chromatogr. B, 681 (1996) 241.
60.Z.K. Shihabi, Electrophoresis, 23 (2002) 1612.
61.趙世彬、鄒煦杕、蔡東璣、陳河吉、周大中、李文齡,「生物化學」,藝軒圖書出版社,台北市,第134-172頁 (2001)。
62.李建雄、翁郁嘉、端木梁、黃淑姿,「生物化學」,藝軒圖書出版社,台北市,第139-149頁 (1996)。
63.M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976) 248.
64.周志宏, 「毛細管區帶電泳應用於嘌呤核苷酸之同步分析研究」, 國立暨南國際大學應用化學所碩士論文, 南投埔里, 台灣 (2005)
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
第一頁 上一頁 下一頁 最後一頁 top
1. 袁建中、曾國雄、康才華、鄭建銓,2003,委外績效評選之多屬性決策:以德霖技術學院電腦室為例,資訊管理學報,第12卷,第1期,頁131-148。
2. 鄧振源、陳哲昌,2003,山坡地最適防災社區管理組織之研究,華梵學報,第9卷,頁77-92。
3. 鄧振源、曾國雄,1989,層級分析法(AHP)的內涵特性與應用(下),中國統計學報,第27卷,第7期,頁13767-13786。
4. 鄧振源、曾國雄,1989,層級分析法(AHP)的內涵特性與應用(上),中國統計學報,第27卷,第6期,頁13707-13725。
5. 鄭惠之,2000,平衡計分卡與績效管理,會計研究月刊,第179期,頁18-25。
6. 詹乾隆、蘇益良,2003,平衡計分卡於銀行策略管理之個案研究,臺灣經濟金融月刊,第39卷,第2期,頁22-35。
7. 楊長林、黃靜蓮,2001,應用平衡計分卡於系所整體績效衡量,管理會計,第57期,頁1-31。
8. 曾國雄、王榮祖,1994,公車系統績效評估之研究:AHP法與FMCDM之應用,中山管理評論,第2卷,第2期,頁1-17。
9. 陳國嘉、陳家祥、姜昭光,2005,運用平衡計分卡建構金融業經營績效指標之研究,育達學院學報,第9期,頁43-61。
10. 吳安妮,2004,銀行業推動平衡計分卡之可行性研究,建華金融季刊,第27期,頁47-80。
11. 吳安妮,2003,平衡計分卡之精隨、範疇及整合(下),會計研究月刊,第212期,頁78-93。
12. 林文恭、王榮祖、蔣昭弘,2005,信託投資公司改制商業銀行之績效評估-納入智慧資本之考量,商管科技季刊,第6卷,第4期,頁601-625。
13. 李建華,1999,從平衡計分卡理論論談會計績效指標之釐訂,會計研究月刊,第163期,頁33-36。
14. 丘昌泰,2002,邁向績效導向的地方政府管理,研考雙月刊,第26卷,第3期,頁46-56。