臺灣博碩士論文加值系統

虱目魚（Chanos chanos、Milkfish）為狹溫性魚種，耐寒性欠佳
(15℃以下即凍死)僅適於高溫下養殖，普遍養殖於台灣之中南部沿海，
每逢冬季寒流來襲之際常大量凍斃，造成養殖業損失嚴重。植物或動
物遇到環境逆境(如Hot or cold stress)，為適應環境之改變，不但會有
生理改變且細胞內各蛋白質之表現上亦會有所改變。因此，本研究先
探討低溫寒害對虱目魚血清中葡萄糖及乳酸之改變情形，並找尋血清
及肌肉之最適二維電泳之前處理及分析條件，虱目魚肌肉採用2D
Sample buffer 或血清以Rehydration buffer 前處理後進行二維電泳所獲
得的分離效果最佳。最後再以蛋白質體學角度探討在低溫刺激下虱目
魚蛋白質之消長變化。結果顯示，虱目魚持續以15℃低溫壓迫時，血
液中葡萄糖及乳酸的濃度皆顯著增加，約48 小時達到最高峰，但隨後
皆降至原先的濃度。虱目魚受到寒害時亦會有明顯的蛋白質消長情
形，甚至產生某些特異性的蛋白質。為比較正常及低溫處理虱目魚之
血清及肌肉蛋白質表現階層的差異性，除了瞭解在低溫逆境下不同組
織部位之蛋白質之種類及含量上的變化外，亦可望獲知經低溫逆境是
否產生某種特異性蛋白質。利用先前之最適前處理條件並進行二維電
泳之分離及染色，配合蛋白質點比對(Image master 軟體)及差異性蛋白
質質譜定序分析，比較低溫逆境下蛋白質種類及含量上的消長變化。

The milk fish usually is cultured in Subtropical area at middle Taiwan
for its vulnerable effects in temperature below 15°C. The massive death
often occurred during winter to bring large economic loss. The physiologic
stress of fish creatures will occur when the dramatically changes of
temperature such as extreme hot or cold. There are many hormone or
regulatory proteins secrete in cells when physiologic stress occur. The
present study intend to clarify the change of plasma glucose and lactate as
well as the changes of serum and muscle proteins in milk fish during cool
temperature.
To separate each protein more identifiable in 2D electrophoresis、the
muscle was pretreated by 2D sample buffer and the serum was pretreated by
rehydration buffer. The concentrations of plasma glucose and lactate
increased significantly to peak at 48 hours and then decline to the normal
level. The obviously changes of proteins occurred after treating with cool
temperature even more some specific proteins induced. Whether some
unknown proteins are induced will be clarified by the comparisons of the
amount and types of proteins in serum and muscle during normal
temperature and cool temperature. Each newly induced protein which
graphically marked by staining and recognized by Image Master can be
identified by MALDI-TOF.

I
目錄
摘要……………………………………………………………………….…1
英文摘要…………………………………………………………………….2
誌謝………………………………………………………………………….3
壹、前言……………………………………………………………….……4
貳、文獻整理...............................................................................................6
2.1 虱目魚及其特性………......................................................................6
2.1.1 虱目魚之分類................................................................................7
2.1.2 虱目魚之成分...............................................................................9
2.1.3 虱目魚之風味...............................................................................9
2.2 低溫刺激下產生的生理變化............................................................11
2.2.1 不同物種於低溫逆境下產生的生理變化…..…..…..………....13
2.2.2 高溫逆境刺激下產生的生理變化…….….……..……….…....14
2.3 蛋白質體(Proteome)的研究……………...……………………...…15
2.3.1 蛋白質體……………...…………………..……………………15
2.3.2 蛋白質研究之演進…………………………………………….17
2.3.3 蛋白質體學(Proteomics)………………………………............18
2.3.4 蛋白質體學技術……………………………………………….19
2.3.5 二維電泳………………………………………...……………..20
II
2.3.6 蛋白質顯色………………………………………………...…..21
2.3.7 質譜（Mass Spectrometry、MS）分析…………………………22
2.3.8 資料庫比對………………………………………………...…..26
2.3.9 蛋白質體學之應用…………………………………...….…….27
參、材料與方法……………………………………………………….…29
3.1 實驗材料…..…………………………………………….………….29
3.2 實驗機器設備……………….………………………….…………..29
3.3 實驗試藥…………………...…………………………….…………30
3.4 實驗架構………………………………………………….………...32
3.5 實驗方法……………………...…………………………….………34
3.5.1 虱目魚肌肉蛋白質之抽取與樣品製備………….……………34
3.5.1.1 虱目魚丙酮粉末之製備………….………………..……...34
3.5.2 虱目魚丙酮粉末連續或抽取水溶性蛋白，鹽溶性蛋白及2D
Sample buffer 可溶性蛋白………………………….…….........34
3.5.2.1 虱目魚丙酮粉末抽取水溶性蛋白……..………...……….34
3.5.2.2 虱目魚丙酮粉末抽取鹽溶性蛋白…………………...…...35
3.5.2.3 以2D Sample buffer 處理虱目魚丙酮粉末………………35
3.5.3 虱目魚丙酮粉末直接抽取水溶性蛋白……………….………..35
3.5.4 虱目魚丙酮粉末直接抽取鹽溶性蛋白………………………...35
III
3.5.5 以2D Sample buffer 直接處理虱目魚丙酮粉末……………….36
3.5.6 以Lysis buffer 直接處理虱目魚丙酮粉末……….……….…….36
3.6 虱目魚新鮮魚肉………………………………………………..…....36
3.6.1 虱目魚新鮮魚肉直接抽取水溶性蛋白…………………..……...36
3.6.2 虱目魚新鮮魚肉直接抽取鹽溶性蛋白……………………….....37
3.6.3 虱目魚新鮮魚肉利用2D Sample buffer 處理之蛋白質…………37
3.6.4 利用2D fractionation kit 抽取虱目魚新鮮魚肉之Lysis buffer 可溶
蛋白質抽取步驟…………………….……………………..……37
3.6.5 2D fractionation kit 之沉澱物蛋白質抽取步驟..……………….38
3.7 虱目魚血清之前處理及樣品製備………………...………………...38
3.7.1 虱目魚血清經10% TCA/Acetone 處理後是否須添加蒸餾水去除
TCA 之影響……………………..………………………………38
3.8 利用不同萃取試劑處理虱目魚血清…………………….……….…39
3.8.1 控制組………………………………………………………...…..39
3.8.2 虱目魚血清經Albumin IgG removal kit 處理……………………40
3.8.3 虱目魚血清經2-D Clean-up Kit 處理…………………………....40
3.8.4 虱目魚血清經Albumin IgG removal kit 及2-D Clean-up Kit
處理……...………………………………………………………40
3.9 虱目魚降溫實驗…………….……………………………………….40
IV
3.9.1 控制組………………………………………………………….....40
3.9.2 實驗降溫組…………………………….…………………...…….41
4.1 血糖測定法…………………………………………………………..41
5.1 乳酸之測定…………………………………………………………..42
6.1 血清中抗體(IgG)親和性管柱之製備與純化……………………….43
6.1.1 血清中抗體(IgG)純化………….....…………………..…………43
6.1.2 將兔子抗虱目魚血清蛋白質之多株抗體(IgG)結合至CNBractivated
Sepharose 4B 之操作……………………………………44
6.1.2.1 膨潤……………………………………………………………44
6.1.2.2 與兔子抗虱目魚血清蛋白質之多株抗體(IgG)結合之操作
步驟…………………………………………………………...44
6.1.2.3 兔子抗虱目魚血清蛋白質之多株抗體親和性膠體製備虱目魚
經Cold shock 所產生之特異性蛋白質………………………44
6.1.3 Sephdex G-50 膠體過濾…….……………………………...……45
7.1 虱目魚加工產品蛋白質之抽出…….…………...…………….…….45
8.1 蛋白質體學分析………...…………………….……………….…….46
8.1.1 蛋白質萃取………………………………………...…………..46
8.1.2 第一維電泳分析……………………………………………….46
V
8.1.2.1 膠體水合………………………………………..…………..46
8.1.2.2 IEF 操作………………….………………….………….…47
8.1.3 第二維電泳分析……………………………………………….48
8.1.3.1 藥品試劑………………………………………….………...49
8.1.3.2 鑄膠………………………………………………….….…..51
8.1.3.3 電泳……………………………………………………..…..52
8.1.3.4 膠片染色…………………………………………………....54
8.1.3.5 膠片掃瞄………………….………………………………...55
8.1.3.6 影像分析比對…………………………….………...………55
8.1.3.7 蛋白質鑑定………………….………………...……………56
(A) 蛋白質膠內消化……………………………………………56
(B) 質譜分析……………………………….……….…………..56
(a) MALDI-TOF 質譜分析…………….……………………….56
(C) 資料庫檢索………………………………………............…57
8.1.4 抗體之製備………………………………………………….…57
VI
8.1.4.1 多株抗體之製備及純化………………………..………..57
(A) 抗原及動物免疫………………………………...………..57
(B) 抗血清之製備…………………………..………………...57
(C) 抗體之純化……………………………………..………....57
8.1.5 免疫轉印……………………..…...……………………………57
(A) 免疫轉印緩衝液…………………………………………..58
(B) 操作步驟..…………………………………………………58
9.1 統計分析……..……………………………………………..............60
肆、結果與討論……………………………………………………………61
4.1 虱目魚馴養過程之變化……………………………………………61
4.2 虱目魚血清中葡萄糖之變化………………………………………63
4.3 虱目魚血清中乳酸濃度之變化……………………………………66
4.4 虱目魚經或未經Cold shock 處理之血清蛋白質Native PAGE
Western blotting 圖…………………………………………………..69
4.5 虱目魚經或未經Cold shock 處理之血清蛋白質SDS PAGE 及
Western blotting 圖…………………………………………………72
VII
4.6 Cold shock 處理之虱目魚血清經兔子抗虱目魚血清IgG 親和性管
柱之未吸附蛋白質的SDS-PAGE 及Western blotting 圖……….75
4.7 不同量之虱目魚血清蛋白質進行二維電泳的分離效果…………78
4.8 虱目魚經Cold shock 處理後不同時間之蛋白質變化……………80
4.9 不同前處理之虱目魚血清進行二維電泳的分離效果……………82
4.10 新鮮血清與凍乾血清之二維電泳分離效果的比較………………84
4.11 虱目魚血清利用市售不同萃取試劑處理之二維電泳分離效果的
比較………………………………………………………………...86
4.12 以最適前處理及萃取條件比較低溫處理與虱目魚血清之
2D 圖譜……………………………………………………………88
4.13 虱目魚低溫處理與否血清2D 圖譜之Image master 比對
與3D 圖…………………………………………………………..91
4.14 經Image master 比對後觀察虱目魚低溫處理與否對血清蛋白質消
長變化之影響……………………………………………………..93
4.15 不同萃取試劑處理之虱目魚肌肉中蛋白質之2D 比較圖……...95
VIII
4.16 以不同萃取試劑序列式處理虱目魚肌肉中蛋白質之二維式膠體
電泳圖……………………………………………………………..97
4.17 不同萃取試劑分別處理肌肉中蛋白質之二維式膠體電泳
比較圖…………………………………………………………….99
4.18 虱目魚肌肉蛋白質經加熱處理後之二維式膠體電泳圖及Western
blotting之比較圖………………………………………………...101
伍、結論………………………………………………………………….103
陸、參考文獻…………………………………………………………….104
七、附表圖
表1、台灣水產養殖面積統計表……………………………………..8
表2、虱目魚營養成分明細表………………………………………..10
表3、台灣主要養殖虱目魚面積及分佈地區之比較表…………….11
表4、虱目魚各種溫度的適應活動力.………………………………12
表5、常用SDS-PAGE膠體溶液………………...……………………51
表6、虱目魚於Cold shock過程血清中葡萄糖濃度之變化…….…65
表7、虱目魚於Cold shock 過程血清中蛋白質濃度之變化……….67
表8、虱目魚於Cold shock 過程血清中乳酸濃度之變化…………68
IX
圖1、電噴灑離子化之原理………………………………………….23
圖2、基質輔助雷射脫附游離離子源（MALDI）之原理…………24
圖3、蛋白質體學流程圖…………………………………………….27
圖4、虱目魚低溫處理與否對血清中蛋白質及成分分析之
實驗架構圖………………………………………………...…32
圖5、虱目魚低溫處理與否對肌肉中蛋白質及成分分析之
實驗架構圖……………………………………………...……33
圖6、虱目魚於馴養期間體長與體重之變化………………………..62
圖7、虱目魚於Cold shock 過程血清中葡萄糖濃度之變化………65
圖8、虱目魚於Cold shock 過程血清中蛋白質濃度之變化……….67
圖9、虱目魚於Cold shock 過程血清中乳酸濃度之變化…………68
圖10、25℃正常溫度及15℃之Cold shock 處理之虱目魚血清中蛋
白質之Native PAGE 及Western blotting 圖…………….…..71
圖11、25℃正常溫度及15℃之Cold shock 處理之虱目魚血清中蛋
白質之SDS-PAGE 及Western blotting 圖………….………74
X
圖12、Cold shock 處理之虱目魚血清經兔子抗虱目魚血清IgG 親和
性管柱之未吸附蛋白質的SDS-PAGE 及Western blotting
圖 …………………………………………………………….77
圖13、虱目魚血清蛋白量之比較圖……………………………….79
圖14、虱目魚經25℃正常溫度及15℃之Cold shock 不同時間處理
血清中蛋白質之二維式膠體電泳圖………………..……….81
圖15、虱目魚經25℃正常溫度及15℃之Cold shock 以不同萃取試
劑處理血清中蛋白質之二維式膠體電圖…………………..83
圖16、經不同前處理之虱目魚血清中蛋白質之二維式膠體電泳圖.85
圖17、不同萃取試劑處理之虱目魚血清中蛋白質之二維式膠體
電泳圖……………...…………………………………………87
圖18、虱目魚經15℃之Cold shock 處理血清中蛋白質之二維式膠
體電泳圖……………………………………………………...90
圖19、虱目魚血清蛋白質之二維式膠體電泳圖及3D 圖………....92
圖20、虱目魚血清蛋白質之二維式膠體電泳蛋白量表現比較圖…94
圖21、不同萃取試劑處理之虱目魚肌肉中蛋白質之二維式膠體
電泳圖………………………………………………………...96
圖22、虱目魚經25℃正常溫度及15℃之Cold shock 以不同萃取試
XI
劑處理肌肉中蛋白質之二維式膠體電泳圖………….……98
圖23、虱目魚經25℃正常溫度及15℃之Cold shock 以不同萃取試
劑處理肌肉中蛋白質之二維式膠體電泳圖……………….100
圖24、虱目魚Cold shock 肌肉蛋白質經加工處理後之二維式膠體電
泳圖及Western blotting……………………………………..102

104
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