臺灣博碩士論文加值系統

掃描式電化學顯微鏡(Scanning Electrochemical Microscopy，SECM )提供一種電化學掃描偵測技巧，具有尖端電極(tip electrode)和受體電極(substrate electrode)兩個工作電極。其中尖端電極對受體電極表面進行掃描偵測，可用以獲得受體電極表面的形貌等資訊。另外SECM具有精確的定位系統，可用來控制尖端電極在受體電極上方進行x、y、z三維方向掃描。SECM使用的尖端電極為超微電極(直徑1~25μm)，因為具有較小工作電極表面積的特點，因此進行電化學反應時，具有能減小溶液IR drop，進行快速的mass transfer反應以及小的充電效應等優點。
本實驗在SECM系統中，對尖端電極和受體電極兩工作電極，分別修飾上葡萄糖氧化酵素(GOx)和過氧化氫酵素(HRP)兩種酵素，選用分析物葡萄糖進行多項SECM偵測實驗。有別於其他SECM利用酵素電極對葡萄糖之偵測，本實驗還嘗試在受體酵素電極上施加不同電位，探討電位對兩工作電極上酵素的催化作用，對葡萄糖偵測之影響。實驗結果指出，受體電極上修飾的HRP會直接影響到SECM系統產生的正回饋作用。當受體電極上有修飾HRP時，且尖端電極與受體電極在兩種酵素相互反應的距離內時，葡萄糖與尖端電極上的GOx作用後產生的H2O2，會立即被HRP催化形成水和氧氣。此時HRP催化H2O2所產生的氧氣又會以擴散的方式回到尖端電極與GOx作用，形成一正回饋作用。而對受體電極施加很大的正電位，會使溶液中水分解成氧氣，增加溶液中氧的量，大幅的提升了本系統的正回饋效應。
本實驗亦嘗試將SECM結合FIA系統，以安培法對葡萄糖進行偵測，在最佳化條件下尖端電極對葡萄糖之偵測，葡萄糖濃度範圍為0.01 ~ 1.0 mM有良好的線性關係(R2＝0.9959)，偵測極限可達到0.007 mM。實驗最後還對真實樣品進行分析，與光譜法對真實樣品偵測的結果很相近，表示此系統對於偵測葡萄糖具有專一性和選擇性，且對葡萄糖之偵測數據能得到可靠的結果。

目 錄
第一章 緒論-------------------------------------------------------------------------1
1.1 掃描式電化學顯微鏡 (SECM )---------------------------------------1
1.1.1 SECM簡介----------------------------------------------------------1
1.1.2 SECM基本原理----------------------------------------------------2
1.1.3 接近曲線-------------------------------------------------------------4
1.1.4 正回饋作用(positive feedback)-----------------------------------6
1.1.5 G/C作用( generation / collection )-------------------------------7
1.2 化學修飾電極-------------------------------------------------------------9
1.2.1 電催化----------------------------------------------------------------9
1.3 酵素簡介-----------------------------------------------------------------13
1.3.1 酵素催化反應的種類--------------------------------------------14
1.3.2 酵素修飾電極-----------------------------------------------------15
1.3.3 固定酵素方式－膠體包覆法-----------------------------------15
1.3.4 葡萄糖氧化酵素( Glucose Oxidase，GOx )簡介-----------16
1.3.5 山葵過氧化酵素( Horseradish peroxidase，HRP )簡介---17
1.3.5.1 HRP催化H2O2之可能機制探討---------------------18
第二章 實驗藥品與儀器--------------------------------------------------------20
2.1 藥 品----------------------------------------------------------------------20
2.2 溶液配製------------------------------------------------------------------21
2.3 儀器設備------------------------------------------------------------------25
2.4 自製尖端電極之製作過程---------------------------------------------27
2.5 酵素電極的修飾過程---------------------------------------------------29
2.6 FIA結合SECM系統--------------------------------------------------30
2.6.1 FIA-SECM的反應槽(cell)設計-------------------------------31
第三章 結果與討論--------------------------------------------------------------33
3.1 SECM對葡萄糖之偵測-----------------------------------------------33
3.1.1 白金電極對葡萄糖偵測之循環伏安法----------------------33
3.1.2 白金電極對H2O2偵測之循環伏安法------------------------34
3.1.3 尖端白金電極對葡萄糖之偵測與分析----------------------35
3.1.4 尖端電極修飾GOx，利用循環伏安法對葡萄糖之偵測
----------------------------------------------------------------------36
3.1.5 SECM系統，尖端電極修飾GOx結合受體電極修飾
HRP，對葡萄糖偵測兩種酵素催化反應之可能作用機制
----------------------------------------------------------------------37
3.1.6 尖端電極修飾GOx，受體電極修飾HRP-Fc，利用循環伏安法對葡萄糖之偵測-------------------------------------------39
3.2 SECM結合系統中酵素電極，受體酵素電極施加電位對葡
萄糖偵測之影響-----------------------------------------------------40
3.2.1 SECM研究回顧-------------------------------------------------40
3.2.2 研究目的----------------------------------------------------------41
3.2.3 SECM結合系統中酵素電極，對葡萄糖進行偵測的實驗
前步驟-------------------------------------------------------------41
3.2.4 SECM酵素電極系統中，受體電極施加正電位時對葡萄
糖之偵測與探討-------------------------------------------------43
3.2.5 SECM結合系統中酵素電極，受體酵素電極施加負電位
時對葡萄糖之偵測與探討-------------------------------------50
3.3 接近曲線------------------------------------------------------------------51
3.3.1 SECM結合酵素電極，受體電極施加負電位時對葡萄糖
偵測之接近曲線探討-------------------------------------------51
3.3.2 SECM結合酵素電極，受體電極施加正電位時對葡萄糖
偵測之接近曲線探討-------------------------------------------52
3.4 影像圖(Image)----------------------------------------------------------55
3.5 SECM系統，葡萄糖與緩衝溶液之循環伏安圖-----------------57
3.6 SECM結合FIA系統之安培偵測法-------------------------------59
3.6.1 SECM結合FIA系統之安培偵測法，對葡萄糖進行偵測
的實驗前步驟----------------------------------------------------59
3.6.2 偵測H2O2之循環伏安圖----------------------------------------59
3.6.3 受體電極電位對偵測葡萄糖最佳化探討--------------------60
3.6.4 尖端電極電位對偵測葡萄糖的最佳化探討-----------------62
3.6.5 載體溶液pH的最佳化探討------------------------------------63
3.6.6 載體溶液流速的最佳化探討-----------------------------------64
3.6.7 測定葡萄糖的校正曲線-----------------------------------------67
3.6.8 偵測葡萄糖電流訊號的再現性--------------------------------69
3.6.9 偵測葡萄糖電流訊號的選擇性--------------------------------71
3.6.10 本實驗與光譜法偵測真實樣品中Glucose含量的比較
----------------------------------------------------------------------75
3.6.11 真實樣品中葡萄糖測定之回收率----------------------------76
3.6.12 本實驗之偵測方法、偵測物、酵素、偵測極限與參考文
獻比較-------------------------------------------------------------77
第四章 結論-----------------------------------------------------------------------78
第五章 參考文獻-----------------------------------------------------------------80











圖 目 錄
圖1 SECM儀器構造圖---------------------------------------------------------2
圖2 SECM原理圖---------------------------------------------------------------4
圖3 SECM之接近曲線圖------------------------------------------------------5
圖4 SECM之正回饋作用示意圖----------------------------------------------6
圖5 SECM之G/C作用示意圖-----------------------------------------------8
圖6 常見的幾種有機電子傳遞媒介物質------------------------------------11
圖7 常見的幾種有機金屬傳遞媒介物---------------------------------------12
圖8 Flavin Adenine Dinucleotide (FAD)分子結構圖----------------------16
圖9 FAD催化反應方程式-----------------------------------------------------17
圖10 Porphyrin分子結構圖---------------------------------------------------18
圖11 HRP催化反應中心結構圖---------------------------------------------18
圖12 HRP催化H2O2反應式-------------------------------------------------19
圖13 自製尖端電極結構圖---------------------------------------------------28
圖14 尖端電極修飾GOx及受體電極修飾HRP-Fc之製備過程圖---
-----------------------------------------------------------------------------29
圖15 SECM結合FIA系統--------------------------------------------------30
圖16 SECM結合FIA之電化學反應槽之設計(a)結構圖，(b)剖面圖
-----------------------------------------------------------------------------31
圖17 FIA-SECM系統，墊片中間孔洞設計圖---------------------------32
圖18 白金電極對葡萄糖溶液掃描之CV圖------------------------------33
圖19 白金電極對H2O2溶液掃描之CV圖--------------------------------34
圖20 尖端電極對葡萄糖溶液掃描之CV圖------------------------------35
圖21 尖端電極修飾GOx，對葡萄糖溶液掃描之CV圖---------------36
圖22 尖端電極修飾GOx結合受體電極修飾HRP-Fc，對葡萄糖偵
測之兩酵素催化反應作用機-----------------------------------------38
圖23 尖端電極修飾GOx，受體電極修飾HRP-Fc，對葡萄糖溶液掃
描之CV圖---------------------------------------------------------------39
圖24 尖端電極修飾GOx，受體電極修飾HRP-Fc，對葡萄糖溶液之
接近曲線圖--------------------------------------------------------------42
圖25 SECM系統結合系統中酵素電極，對酵素受體電極施加正電
位的反應機制圖----------------------------------------------------------44
圖26 SECM結合系統中酵素電極，受體酵素電極施加不同正電位，
對葡萄糖掃描之CV圖------------------------------------------------46
圖27 SECM結合系統中酵素電極，受體電極未修飾HRP-Fc且施加
不同正電位，對葡萄糖溶液掃描之CV圖---------------------------47
圖28 SECM結合系統中酵素電極，受體電極未修飾Fc，對葡萄糖
溶液掃描之CV圖--------------------------------------------------------49
圖29 SECM系統，電子傳遞Fc衍生物降低偵測O2還原電位之可
能機制示意圖-------------------------------------------------------------49
圖30 SECM結合系統中酵素電極，受體酵素電極施加不同負電位，
對葡萄糖溶液掃描之CV圖-------------------------------------------50
圖31 SECM結合系統中酵素電極，尖端電極施加電位0.8V，受體
電極施加電位-2.0V，對葡萄糖溶液偵測之接近曲線圖--------
-----------------------------------------------------------------------------52
圖32 SECM結合系統中酵素電極，尖端電極施加電位0.6V，受體
電極施加電位1.4V，對葡萄糖溶液偵測之接近曲線圖--------
-----------------------------------------------------------------------------53
圖33 SECM結合系統中酵素電極，經過圖32接近程序後，尖端電
極在最接近受體電極表面時對葡萄糖溶液掃描之CV圖---------
-------------------------------------------------------------------------------54
圖34 SECM結合系統中酵素電極，對葡萄糖偵測之影像圖---------56
圖35 SECM結合系統中酵素電極，對葡萄糖偵測之3D結構圖----
-------------------------------------------------------------------------------56
圖36 SECM結合系統中酵素電極，受體酵素電極施加電位1.4V對
空白溶液掃描之CV圖-------------------------------------------------57

圖37 FIA-SECM系統，對H2O2溶液掃描之CV圖--------------------60
圖38 FIA-SECM系統，受體電極施加不同電位，對葡萄糖溶液偵
測之受體電極電位對電流關係圖-------------------------------------61
圖39 FIA-SECM系統，尖端電極施加不同電位，對葡萄糖溶液偵
測之尖端電極電位對電流關係圖-------------------------------------62
圖40 FIA-SECM系統，改變載體溶液pH值，對葡萄糖溶液偵測之
pH對尖端電極電流關係圖---------------------------------------------64
圖41 FIA-SECM系統，改變載體溶液流速，對葡萄糖溶液偵測之
時間對尖端電極電流圖-------------------------------------------------65
圖42 FIA-SECM系統，改變載體溶液流速，對葡萄糖溶液偵測之
流速對尖端電極電流關係圖-------------------------------------------66
圖43 FIA-SECM系統，對不同葡萄糖濃度偵測之時間對尖端電極
電流圖----------------------------------------------------------------------68
圖44 FIA-SECM系統，對不同葡萄糖濃度(0.01~10 mM)偵測之校正
曲線圖----------------------------------------------------------------------68
圖45 FIA-SECM系統，對不同葡萄糖濃度(0.01~1.0 mM)偵測之校
正曲線圖-------------------------------------------------------------------69
圖46 FIA-SECM系統，對葡萄糖溶液偵測之再現性圖----------------70
圖47 FIA-SECM系統，連續偵測葡萄糖訊號對電流訊號強度關係
圖----------------------------------------------------------------------------70
圖48 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Ascorbic acid)偵測之i-t圖----------------------------------------------72
圖49 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Fructose)偵測之i-t圖----------------------------------------------------72
圖50 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Urea)偵測之i-t圖---------------------------------------------------------73
圖51 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Uric acid)偵測之i-t圖---------------------------------------------------73
圖52 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Hydroquinone)偵測之i-t圖---------------------------------------------74
圖53 FIA-SECM系統，對1 mM葡萄糖與(1 mM葡萄糖＋1 mM
Catechol)偵測之i-t圖----------------------------------------------------74

















表目錄
表1 SECM結合酵素電極，偵測葡萄糖最佳化條件---------------------58
表2 FIA-SECM系統，以安培偵測法偵測葡萄糖最佳化條件---------66
表3 本實驗與glucose assay kit對真實樣品偵測之比較-----------------75
表4 本實驗對真實樣品偵測之回收率--------------------------------------76
表5 為不同偵測葡萄糖方式與本實驗的比較-----------------------------77

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