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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:詹博雄
研究生(外文):Po-Hsiung Chan
論文名稱:以微滲透式系統進行快速蛋白質結晶條件篩選之研究
論文名稱(外文):Rapid Protein Crystallization by Micro Osmotic Screening System
指導教授:蘇育全蘇育全引用關係
指導教授(外文):Yu-Chuan Su
學位類別:碩士
校院名稱:國立清華大學
系所名稱:工程與系統科學系
學門:工程學門
學類:核子工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:85
中文關鍵詞:蛋白質結晶滲透微流體
外文關鍵詞:protein crystallizationosmosismicrofluidics
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本研究成功的以微滲透式系統進行蛋白質結晶條件的快速篩選,利用滲透作用,每單位體積的蛋白質樣品可被用來在更大範圍的濃度與速度參數值中篩選出結晶條件,如此將有效降低蛋白質樣品的需要量。這些功能是利用半透膜控制滲透作用所達成,藉由驅動並控制水份離開蛋白質溶液的速度以調整蛋白質溶液的濃度與其改變率,進行快速且可機動調整的蛋白質結晶條件篩選。這套蛋白質結晶條件篩選系統的雛型 (6×8陣列,6個獨立參考溶液流道,長24mm、寬20mm、厚度2.5mm) 主要是以高分子板材與半透膜為材料所製成,並藉由熱壓與熱熔所組裝而成。到目前為止,這套系統已經成功應用在四種不同的蛋白質,包括Lysozyme、Catalase、Thaumatin及Xylanase的分析,每單位蛋白質樣品的體積為400nl。測試結果顯示可以在1-3小時內篩選出蛋白質結晶的適當條件,除此之外,利用此系統可長出大小超過100μm的蛋白質晶體,品質足以提供X光繞射儀進行繞射分析,產生足以反解出蛋白質結構的資訊。如此一來,這套微滲透式篩選系統將可做為一個創新並具有高效能的蛋白質結晶條件篩選系統。
This work presents a micro osmotic screening system that grows protein crystals in hours with microgram samples. In each crystallization cell, water is driven in or out of a protein solution (across a semi-permeable membrane) to adjust its concentrations. Employing the bi-directional flow control realized by osmosis, each protein sample can be screened for crystallization conditions over highly extended ranges. In the prototype demonstration, 6 x 8 arrays with an overall size of 20 x 24 x 2.5 mm3 are fabricated and tested in the crystallization experiments. Crystallization conditions for lysozyme, catalase, thaumatin, and xylanase are identified within 1 to 3 hours while consuming less than 20 μl of protein solution each. Furthermore, it is also demonstrated that diffraction-quality crystals may be grown and harvested from the prototype systems. As such, this osmotic system pioneers a new class of rapid screening schemes for high-through- put protein crystallization.
摘要 I
ABSTRACT II
誌謝 III
目錄 IV
圖目錄 VI
表目錄 X
第1章 緒論 1
1.1 前言 1
1.2 蛋白質結晶相圖[1][2] 2
1.3 蛋白質結晶方法 3
1.3.1 蒸汽擴散法(vapor diffusion method) [3] 4
1.3.2 批式結晶法(Batch Crystallization method)[3] 7
1.3.3 自由界面擴散法(Free interface diffusion)[3] 8
1.3.4 透析法(Dialysis)[5] 8
1.4 文獻回顧 9
1.4.1 自由界面擴散法(Free interface diffusion) 9
1.4.2 微批式結晶法(Microbatch Crystallization Method) 12
1.4.3 透氣膜結晶法(Gas-permeable membrane crystallization method) 13
1.4.4 不同蛋白質結晶方法比較 14
1.5 研究目標 17
第2章 蛋白質結晶相關原理 18
2.1 蛋白質結晶的原理 18
2.1.1 蛋白質成核與自由能的關係[1] 18
2.1.2 蛋白質溶液的相互作用[5] 20
2.2 影響蛋白質結晶之參數[9] 23
2.2.1 pH值 23
2.2.2 離子強度(Ionic strength) 25
2.2.3 鹽類的本性(Nature of salts) 30
2.2.4 溫度(Temperature) 31
2.3 滲透作用 32
第3章 實驗設計與製程 34
3.1 蛋白質結晶方法流程圖 35
3.2 沉澱劑的設計 36
3.3 沉澱劑組成與調配方法 41
3.3.1 緩衝液的選擇 41
3.3.2 蛋白質結晶的鹽類 41
3.4 本研究所使用的蛋白質種類 42
3.5 蛋白質結晶裝置設計 43
3.6 蛋白質結晶裝置製程 46
3.6.1 熱熔膠溶液 46
3.6.2 CNC銑削蛋白質結晶結構製程步驟 46
3.6.3 高效率半透膜製作步驟 48
3.6.4 蛋白質結晶晶片組裝步驟 49
3.7 蛋白質晶體成長的觀察與紀錄 51
第4章 實驗結果與討論 52
4.1 半透膜透水速率測試 52
4.2 蛋白質結晶晶片實驗結果 56
4.2.1 Lysozyme蛋白質 57
4.2.2 Catalase蛋白質 64
4.2.3 Thaumatin 蛋白質 68
4.2.4 Xylanase蛋白質 73
4.2.5 Hemoglobin蛋白質 78
4.3 X光繞射與晶體結構 79
第5章 結論 83
參考文獻 84
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