臺灣博碩士論文加值系統

摘 要

麥芽寡糖苷海藻糖水解酶 (maltooligotrehalose trehalohydrolase, MTHase) 可水解麥芽寡糖苷海藻糖分子上鄰近 α-1,1 鍵結之 α-1,4 鍵結，進而產生海藻糖，但也能水解麥芽寡糖分子還原端之 α-1,4 鍵結，水解產生葡萄糖，造成海藻糖的產率下降。本實驗藉由針對與基質次結合部位相關之胺基酸進行定位點突變，探討這些活性部位胺基酸殘基對於 MTHase 活性與基質選擇性之影響。

利用定位突變方式得到突變型 MTHase 之基因，於 E. coli 表現蛋白質，純化後突變型 FXXX MTHase 之比活性和原生型的相當，其餘突變型酵素的比活性介於原生型 MTHase 的 18.7% 與 77.1% 之間。經過 80oC 保溫 2 小時後，突變型酵素的熱穩定性和原生型酵素相近，顯示突變型酵素具有穩定的構型。另外突變型酵素的最適作用 pH 和原生型酵素相同，皆為 pH 5.0。突變型 HXXX 和 KXXX MTHases 的最適作用溫度降為 75oC，HXXXX MTHase 最適作用的溫度範圍介於 65-85oC 之間，而原生型與突變型 FXXX、KXXX、KXXX、KXXX 與 NXXX 等 MTHases 其餘突變酵素的最適作用溫度皆為 85oC。

經動力學分析結果顯示，原生型與突變型 HXXX、HXXX、FXXX、KXXX、KXXX、KXXX、KXXX 與 NXXX 等 MTHases酵素水解海藻糖苷麥芽寡糖之催化效率 (kcat/Km)，分別為 149.6、40.4、45.2、136.4、114.5、112.3、108.0、135.3 和 22.2 S-1．mM-1；在 MTHase 水解麥芽寡糖的催化能力方面，則分別為 3.00、2.86、4.01、3.93、3.00、3.91、4.39、3.71、0.44 S-1．mM-1。根據 Δ(ΔG) (transition-state energy) 變化量，突變型 HXXX 與 HXXX MTHase 可能因 HXXX 殘基在突變成 XX 或 XX後，破壞了 MTHase 與 G3T 間的氫鍵 (Δ(ΔG) 分別為 3.63 與3.31)，使其基質親和性大幅的下降。另外NXXX MTHase則因 NXXX 殘基在突變成 X 後，同時喪失了 MTHase 與 G3T 和 G5 間的氫鍵 (Δ(ΔG) 分別為 5.28 與 5.31)，造成基質親和性的大幅下降。

在海藻糖的產量試驗方面，FXXX、KXXX、KXXX、KXXX與NXXX MTHase 所生產海藻糖的產量比原生型 MTHase 高，顯示這些突變的確能減少 MTHase 水解產生葡萄糖的副反應，增加海藻糖的產量，尤其以 NXXX MTHase 產量為最高，較原生型酵素產量高了 3%。

目錄
目錄………………………………………………………………… vi
表目錄……………………………………………………………… x
圖目錄……………………………………………………………… xi
附錄目錄…………………………………………………………… xii
壹、前言…………………………………………………………. 1
貳、文獻整理…………………………………………………….. 3
一、海藻糖的簡介………………………………………………… 3
1. 物化特性………………………………………………….. 3
2. 生理特性…………………………………………………..... 3
3. 營養價值…………………………………………………….. 4
3.1.食用安全性………………………………….………….. 4
3.2.骨質疏鬆症的預防…………………………..…....…... 4
3.3.減輕亨丁頓氏舞蹈症 (Huntington disease) 病症..... 5
4. 海藻糖之生產……………………………………………….. 5
4.1. 酵素生物轉換法…………………………………………… 5
4.2. 熱穩定酵素轉換法生產海藻糖…………………………… 6
二、麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之相關研究…………………. 7
1. α-澱粉酶家族 (α-amylase family)……………..………. 7
2. 麥芽寡糖苷海藻糖水解酶的簡介….………………… 8
3. 麥芽寡糖苷海藻糖水解酶的結構……………………. 9
3.1. 結構概說…………………………………..………….. 9
3.2. 基質結合………………………………………..…….. 10
4. 麥芽寡糖苷海藻糖水解酶作用機制…………….…………… 11
4.1. 水解作用由還原端或非還原端開始？……………………. 11
4.2. 催化機制假說………………………………………………. 12
参、材料與方法………………………………………………. 13
一、材料…………………………………………………………… 13
1. 質體與菌株…………………………………............. 13
1.1. tre Z基因來源………………………………….......... 13
1.2. 質體來源………………………..……................. 13
1.3. 菌株來源………………………………………….... 13
2. 標準品…………………………………………….…. 13
3. 酵素…………………………………………………….…. 13
4. 化學藥品………………………………………………….. 14
5. 實驗設備……………………………………………….…. 15
二、實驗方法………………………...................... 17
1. 麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之蛋白質工程……………….. 17
1.1. 宿主與培養基的選擇…………………………......... 17
1.2. 質體DNA的製備……………………………........... 17
1.3. LB液體培養基之製備……………………............. 18
1.4. DNA 之定量……………………………………………… 18
1.5. 點突變……………………………………............. 19
1.5.1. 點突變引子組之設計………………………………… 19
1.5.2. 點突變引子之合成…………………………………… 19
1.6. 點突變 PCR 反應的條件…………................... 20
1.6.1. PCR 反應溶液……………………………….………... 20
1.6.2. 點突變 PCR 反應條件………………………………. 20
1.6.3. dsDNA template之剪切……………………………….. 21
1.7. 電穿孔 (electroporation) 勝任細胞的製備與保存.21
1.8.超級 (ultra) 勝任細胞 (E. coli DH5α)…………... 21
1.9.點突變 DNA 之轉形作用 (transformation)…….. 23
1.9.1. 熱休克 (heat shock)………………………………….. 23
1.9.2. 電穿孔轉型作用 (electroporation)………. 23
1.10. 以 colony PCR 篩選轉形株 (transformed colony)... 23
1.10.1. colony PCR 反應之溶液組成………………………. 24
1.10.2. colony PCR 反應條件……………………….………. 24
1.10.3. 膠體電泳分析………………………………………. 25
1.11. 序列分析……………………………………………... 25
2. 麥芽寡糖苷海藻糖水解酶的表現與純化……………….. 25
2.1. MTHase於大腸桿菌中之表現…………………………….. 25
2.2. MTHase之純化……………………………………………... 26
2.3. 蛋白質定量…………………………………………..... 26
2.3.1. 定量蛋白質之相關試劑的製備……………………… 27
2.4. 蛋白質電泳分析……………………………………..... 27
2.4.1. 膠體成份……………………………………………… 27
2.4.2. 膠體製備……………………………………………… 28
2.5. 膠電泳之操作方法…………………………………..... 28
2.5.1. 2X SDS sampling buffer的製備………………………. 28
2.5.2. 膠片的染色與脫色…………………………………… 29
2.5.3. 染色液的製備………………………………………… 29
2.5.4. 脫色液的製備………………………………………… 29
3. MTHase生成海藻糖酵素活性之分析………………….….. 29
3.1. MTHase所需基質的製備………………………………….. 29
3.2. DNS-reagent的製備.…………………………………….. 30
3.3. MTHase酵素生成海藻糖活性的測定…………………….. 30
4. 原生型與突變型MTHase之特性探討………………………. 31
4.1 MTHase之最適作用溫度…………………………………… 31
4.2 MTHase之最適作用pH值………………………………… 31
4.3 MTHase之熱穩定性探討…………………………………… 31
5. 酵素動力學之分析……………………………………….. 31
5.1. 生成海藻糖活性之動力學分析……………………………. 31
5.2. 產生葡萄糖活性之動力學分析……………………..... 32
5.2.1.葡萄糖之標準曲線…………………………………….. 32
5.2.2. Glucose assay reagent 的製備…………………… 32
5.2.3. MTHase酵素產生葡萄糖活性之測定……………….. 32
6. 海藻糖產量試驗………………………………………….. 33
肆、結果與討論…………………………………………………… 34
一、麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之蛋白質工程…………………… 34
1. 突變位置的設計…………………………………………….. 34
2. 突變基因的建構…………………………………………….. 35
2.1. 點突變寡核苷酸引子的設計與分析.…………………… 35
2.2. 進行pET-15b-△H-treZ質體中treZ基因之點突變…….. 36
2.3. 菌種保存…………………………………………………. 37
二、麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之蛋白質表現與純化………. 38
1. 菌體培養和破碎…………………………………………….. 38
2. 熱處理……………………………………………………….. 38
3. 離子交換層析……………………………………………….. 38
4. 確認蛋白質大小及純度………………………………………. 39
三、麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之特性探討…………………… 39
1. 最適作用溫度……………………………………………….. 39
2. 最適作用pH……………………………………………………. 39
3. 熱穩定性………………………………………………….. 40
四、麥芽寡糖苷海藻糖水解酶之酵素動力學探討………….. 40
1. 數據處理…………………………………………………… 40
2. 原生型與突變型 HXXX、HXXX MTHases 之酵素動力學分析 41
3. 原生型與突變型 KXXX、KXXX MTHases 之酵素動力學分析 42
4. 原生型與突變型FXXX、KXXX和KXXX MTHases 之酵素動力學分析 43
5. 原生型與突變型NXXX MTHases 之酵素動力學分析.. 43
五、海藻糖產量試驗……………………………………………… 44
1. 產量試驗的作用條件…………………………………….. 44
2. 海藻糖生成速率與葡萄糖生成速率…………………….. 45
3. 最終海藻糖的產量……………………………………….. 46
伍、未來期望………………………………………………….… 48
陸、結論………………………………………………………… 49
柒、參考文獻……………………………………………………… 50

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