臺灣博碩士論文加值系統

研究利用溶膠凝膠法(sol-gel) 以Cysteamine當作催化劑在pH=7下，固定化D型氨基酸氧化脢(D-amino acid oxidase; DAAO)及融合有細菌血紅素之D型氨基酸氧化脢 (VHb-DAAO)，tetramethylorthosilicate(TMOS)的溶膠經由水解、縮合反應，室溫下乾燥兩天後，最終凝固成為玻璃結構之固體，包埋在此結構中的酵素因活動空間被侷限著，使得影響其活性之三級結構亦被固定，酵素的活性因此亦可被保護著。利用溶膠凝膠法固定化酵素，可以大幅提升酵素之耐酸、鹼及溫度之範圍。溶膠凝膠固定化法也有利於同時固定化其他相關之酵素，本論文將catalase與DAAO同時固定化以分解DAAO反應所產生的H2O2，以使反應速率提升。在共固定化catalase之後DAAO及VHb-DAAO的反應重複使用性大幅提高。由於DAAO反應需要氧的參與，所以在固定化酵素反應時持續通入氧氣，可以增加其反應速率，使pyruvic acid產量提升。酵素反應動力學參數之Km、Vmax 、kcat 三者來看， 自由態的酵素都大於固定化酵素，在固定化酵素中， VHb-DAAO之kcat值較DAAO來的大，表示利用溶膠凝膠法固定化時，融合VHb於DAAO上有助於提升DAAO之反應性。

Sol-gel method was employed to encapsulate D-amino acid oxidase (DAAO) and bacterial hemoglobin fused DAAO (VHb-DAAO) by using cysteamine as a catalyst at neutral pH. The sol was prepared by using TMOS. After hydrolysis and condensation of TMOS catalyzed by cysteamine for 30 min at 4 0C, a gel containing added enzymes was obtained. A glass-like solid was obtained after drying the gel at room temperature for two days. The pH and temperature stability of the DAAO were enhanced significantly after encapsulated in silica glass. Catalase was co-encapsulated with DAAO in the glass in order to remove H2O2 produced from DAAO reaction with D-amino acid. Co-encapsulated with catalase, the reaction rate of immobilized DAAO was greatly improved and so did its repeated use. Since O2 is involved in DAAO catalyzed reaction, the constant supply of O2 is required to drive the reaction to completion. Based on the reaction kinetic constants kcat of immobilized DAAO and VHb-DAAO, VHb fused with DAAO did improve the reaction rate of DAAO inside the O2 limited silica glass.

目錄
第一章 緒論…………………………………………………………….1
1.1 研究背景………………………………………………………1
1.2 研究內容及目的………………………………………………2
第二章 文獻回顧………………………………………………………4
2.1 D型氨基酸氧化酶…………………………………………….4
2.1.1 DAAO基因的來源………………………………………….4
2.1.2 DAAO的反應機制………………………………………….4
2.1.3 α-酮酸的應用…………………………………………....5
2.2 VHb融合蛋白………………………………………………….6
2.3 生物矽礦化合成機制………………………………………....8
2.4 溶膠凝膠法(sol-gel)理論………………………………….11
2.4.1 溶膠凝膠法技術背景與發展沿革...................................14
2.4.2 影響溶膠凝膠反應的因素...............................................15
2.5 溶膠凝膠法在固定化生物觸媒之應用…………………...…22
第三章 實驗流程、材料與方法……………………………………...25
3.1 實驗流程……………………………………………………...25
3.1.1 DAAO及VHb-DAAO酵素的表現及純化………………....25
3.1.2 利用溶膠-凝膠法(sol-gel)固定化酵素…………………25
3.1.3 固定化酵素之活性及穩定性…………………………...26
3.1.4 重覆批式反應……………………………………….…..26
3.1.5 反應動力學探討………………………………………...27
3.2 實驗材料……………………………………………………...27
3.2.1 質體及菌株………………………………………….......27
3.2.1.1 菌株………………………………………………....27
3.2.1.2 質體………………………………………………....27
3.2.2 實驗藥品…………………………………………….......28
3.2.3 實驗設備…………………………………………….......28
3.3 藥劑製備……………………………………………………...30
3.3.1 培養基…………………………………………………...30
3.3.2 試劑……………………………………………………...30
3.3.3 蛋白質膠片……………………………………………...33
3.4 實驗方法……………………………………………………...34
3.4.1 E.coli菌株培養生產DAAO及VHb-DAAO……………...34
3.4.2 可溶蛋白中DAAO及VHb-DAAO純化…………………...35
3.4.3 蛋白質之濃度分析……………………………………...35
3.4.4 DAAO活性分析………………………………………......36
3.4.4.1 H2O2檢測法(動力學檢測方法) ……………..…..…..37
3.4.4.2 pyruvic acid檢測法…………..……………..…..38
3.4.5 溶膠凝膠(sol-gel)製備…..……………......................39
3.4.6 酵素pH穩定分析.…………….......................................40
3.4.7 固定化酵素pH穩定分析................................................40
3.4.8 酵素熱穩定分析..............................................................41
3.4.9 固定化酵素熱穩定分析..................................................41
3.4.10 Catalase效應分析.........................................................42
3.4.11 重複性使用分析..............................................................42
3.4.12 溶氧效應..........................................................................43
3.4.13 酵素動力學分析..............................................................43
第四章 結果與討論..............................................................................45
4.1 DAAO及融合VHb之DAAO表現及純化.................................45
4.2 利用仿生觸媒於溶膠凝膠法(sol-gel)固定化酵素..........46
4.3 溶膠凝膠固定化DAAO及VHb-DAAO之穩定性....................49
4.3.1 pH穩定度效應...............................................................49
4.3.2 熱穩定性........................................................................51
4.4 H2O2的影響及catalase的效應.......................................... 54
4.5 固定化酵素矽膠之重複使用性............................................56
4.6 溶氧效應................................................................................60
4.7 間歇性通氧效應....................................................................61
4.8 DAAO與VHb-DAAO反應動力學之探討.................................63
第五章 結論..........................................................................................68
參考文獻................................................................................................70















表目錄
表 2.1 催化劑對溶膠凝膠的影響.......................................................19
表 2.2 sol-gel 反應過程中較常使用的溶劑及其物性...................21
表 2.3以溶膠凝膠法包埋生物觸媒之範例........................................23
表2.4 利用溶膠凝膠法製作光學及電化學生物感測器之範例........24














圖目錄
圖 2.1 DAAO反應機制...........................................................................5
圖 2.2不同來源之矽藻細胞壁結構電子顯微鏡分析.........................9
圖 2.3 Cylindrotheca fusifornis的silaffins分析...................9
圖 2.4 (a)R5之胺基酸結構及修飾圖(b)長鏈型多胺的化學結構圖…………………………………………………………………10
圖 2.5氧化矽聚合之性質...................................................................13
圖 2.6溶膠-凝膠法之水解與縮合反應式之圖示..............................14
圖 2.7為pH值對水解縮合的影響.....................................................17
圖 2.8 pH值對Si－water系統之膠體影響.....................................18
圖 2.9 鍵結在矽上取代物之誘發效應..............................................19
圖 3.1 DAAO表現質體.........................................................................27
圖 3.2 VHb-DAAO表現質體.................................................................27
圖 3.3 Sol-gel固定化酵素製作流程圖...........................................39
圖 4.1含pDAO-30及pVD質體之E.coli BL21(DE3)表現之蛋白質及經IMAC純化後SDS-PAGE.........................................................45
圖 4.2溶膠凝膠固定化酵素反應示意圖...........................................48
圖 4.3加入Cysteamine(a)與不加(b)催化溶膠(sol)成凝膠(gel)的過程……………………………………………………………48
圖 4.4凝膠經乾燥後之成品…………………………………………49
圖 4.5 pH值穩定性DAAO…………………………………………….51
圖 4.6 pH值穩定性VHB-DAAO……………………………………….51
圖4.7熱穩定性DAAO………………………………………...……….53
圖4.8熱穩定性VHB-DAAO…………………………………...……….53
圖4.9為DAAO反應機制…………………………...…………...…….55
圖4.10含有catalase的膠體……………...……………..…...…….55
圖4.11 catalase對固定化DAAO的影響…………..…...…………..56
圖4.12固定化DAAO重複使用性………..…………….....…………..58
圖 4.13固定化DAAO長時間重複使用性…….....…………………...58
圖 4.14固定化VHb-DAAO重複使用性.....…………………...............59
圖 4.15固定化VHb-DAAO長時間重複使用性………........................59
圖4.16固定化酵素溶氧關係圖……...................................................60
圖 4.17固定化酵素間接性通氧效應的影響......................................62
圖 4.18 D-alanine轉化率與時間關係..............................................62
圖 4.19酵素反應速率與基質濃度之關係..........................................65
圖 4.20固定化酵素反應速率與基質濃度之關係..............................65
圖 4.21酵素的Lineweaver-Burk雙倒數圖......................................66
圖 4.22固定化酵素的Lineweaver-Burk雙倒數圖..........................66

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