臺灣博碩士論文加值系統

豬胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 會引起豬隻出血性、纖維性、壞死性胸膜肺炎，造成豬場嚴重之經濟損失。A. pleuropneumoniae 的致病因子包括莢膜多醣、脂多醣、外膜蛋白、吸附因子以及外毒素，其中又以Apx外毒素與毒力最為相關。ApxI、ApxⅡ為A. pleuropneumoniae所分泌之外毒素，ApxI具有很強之溶血性與細胞毒性，ApxⅡ亦具有微弱之溶血性與細胞毒性，前毒素ApxIA與ApxⅡA分別為ApxI與ApxⅡ的結構蛋白，ApxIA與ApxⅡA分別被ApxIC與ApxⅡC乙醯活化前不具有毒性。外膜蛋白暴露於病原體的表面，被免疫系統辨識而誘發免疫反應的機率較其他非外膜蛋白高，經常被用來作為疫苗研發之標的。此外A. pleuropneumoniae 要產生完整的毒力需要吸收宿主體內的含鐵蛋白來取得鐵元素，其所能利用的含鐵蛋白包括轉鐵蛋白 (transferrin)、鐵血紅素 (haem)、血紅蛋白 (haemoglobin)等。本研究即以ApxIA、ApxⅡA、OmlA (外膜脂蛋白)、HgbA作為目標抗原，研發對抗豬胸膜肺炎放線桿菌之DNA疫苗，將目標抗原的基因選殖入能在哺乳類細胞表現的載體，並以DNA定序分析驗證其正確性，再將此DNA疫苗轉染至豬腎細胞 (LLC-PK1)內，並以西方點墨法檢測蛋白質表現，證實此等目標抗原可表現於哺乳類細胞。個別將四種DNA疫苗及包含四種DNA疫苗之四合一疫苗以肌肉注射免疫小鼠，來評估此等DNA疫苗之效用，並以市售之不活化豬胸膜肺炎放線桿菌疫苗作為陽性對照，以空載體、PBS作為陰性對照。除空載體組、PBS組外，第二次免疫後小鼠血清之抗體效價皆有顯著性之增加，免疫過之小鼠於第一次免疫後24天以5x108 colony-forming unit (cfu)第一血清型之豬胸膜肺炎放線桿菌進行攻毒，各組小鼠攻毒後之存活率如下：四合一疫苗組為67%；ApxIA組為50%；ApxⅡA組、OmlA組、市售疫苗組為25%；HgbA組、空載體組、PBS組為0%。實驗結果顯示四合一DNA疫苗具有最佳之保護效用，並優於市售疫苗，證實本實驗所研發之DNA疫苗可作為對抗豬胸膜肺炎放線桿菌感染之新策略。

Actinobacillus pleuropneumoniae can cause haemorrhagic, fibrinous and necrotic pleuropneumonia in pigs that causes critical economic losses in pig farm. Virulence factors of A. pleuropneumoniae include the capsular polysaccharides, lipopolysaccharides, outer membrane proteins, adhesion factors and exotoxins. Virulence is strongly correlated with the Apx toxins. ApxI and ApxⅡ are exotoxins of A. pleuropneumoniae. ApxI is strongly hemolytic and strongly cytotoxic. ApxⅡ is weakly hemolytic and weakly cytotoxic. Pretoxins ApxIA and ApxⅡA are structural proteins of ApxI and ApxⅡ, respectively. ApxIA and ApxⅡA are non-toxic before they are acetylated by ApxIC and ApxⅡC, respectively. Outer membrane proteins are exposed on the surface of pathogen, which are more accessible for immune system to induce immune responses than other proteins and usually be used as candidates for vaccine development. A. pleuropneumoniae needs to obtain iron from iron-containing proteins of the host to express full virulence. These iron-containing proteins include transferrin, haem, and haemoglobin.
In this study, ApxIA, ApxⅡA, OmlA and HgbA were chosen as the target antigens for DNA vaccine development against A. pleuropneumoniae. These genes were cloned to vectors that can express antigens in mammalian system and inserted genes were confirmed by DNA sequencing analysis. The swine kidney cell line LLC-PK1 was transfected with these DNA constructs and detected the expressed proteins by Western blot analysis to demonstrate these proteins can be expressed in mammalian cells.
To evaluate the potency of these DNA vaccines, each DNA vaccine and a mixture vaccine containing above four DNA constructs (4 in 1 vaccine) were administrated into mice by intramuscular injection. A commercial inactivated A. pleuropneumoniae vaccine also used as positive control, empty vector and PBS as negative control. The titers of antisera increased significantly except empty vector and PBS group after second immunization. These mice were challenged with 5x108 colony-forming unit (cfu) of serotype 1 of A. pleuropneumoniae after 24 days of first immunization. The survival rate of each group after 5 days of challenge was as following: 67% for 4 in 1 vaccine; 50% for ApxIA vaccine; 25% for ApxIIA, OmlA and commercial inactivated vaccine; 0% for HgbA, empty vector and PBS group. The results showed that the 4 in 1 DNA vaccine could obtain the best protective efficacy and better than the commercial inactivated vaccine. It indicates that these DNA vaccines used in this study could be a new strategy against infection by A. pleuropneumoniae.

目錄 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Ⅰ
表目錄 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Ⅴ
圖目錄 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Ⅵ
中文摘要 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
英文摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 2
第一章 前言 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
1.1 豬胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae) •••••••••••••• 4
1.1.1 豬胸膜肺炎放線桿菌之簡介 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
1.1.2 豬胸膜肺炎放線桿菌之分類 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
1.1.3 豬胸膜肺炎放線桿菌之流行病學 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6
1.1.4 豬胸膜肺炎放線桿菌之致病因子 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 6
1.1.4.1 纖毛 (fimbriae) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
1.1.4.2 脂多醣 (LPS) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
1.1.4.3 RTX (repeats-in-toxin)毒素 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
1.1.4.4 鐵離子限制因子 (iron-restriction factor) ••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
1.1.5 目前對豬胸膜肺炎放線桿菌之預防與治療方法 •••••••••••••••••••••• 10
1.2 DNA疫苗 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
1.2.1 DNA疫苗之發展起源 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
1.2.2 DNA疫苗之作用機制 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
1.2.3 配合DNA疫苗所使用之佐劑 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14
1.3 豬胸膜肺炎放線桿菌之抗原介紹 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
1.3.1 文獻上研發對抗豬胸膜肺炎放線桿菌疫苗採用之抗原 •••••••••• 15
1.3.2 本實驗研發DNA疫苗所選用之目標抗原 •••••••••••••••••••••••••••••••• 17
1.3.2.1 ApxIA •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
1.3.2.2 ApxⅡA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
1.3.2.3 OmlA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
1.3.2.4 HgbA ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 20
1.4 實驗目的與設計 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
第二章 材料與方法 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
2.1 豬胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因之選殖 •••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
2.1.1 豬胸膜肺炎放線桿菌菌株來源 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
2.1.2 豬胸膜肺炎放線桿菌菌體培養 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
2.1.3 豬胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA之萃取 •••••••••••••••••••••••••••••••• 23
2.1.4 DNA聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) ••••••••• 24
2.1.5 洋菜膠電泳 (agarose gel electrophoresis) ••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
2.1.6 目標抗原DNA之純化 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25
2.2 豬胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因質體之建構 •••••••••••••••••••••••••• 25
2.2.1 以pcDNATM3.1 表現質體接合目標抗原DNA •••••••••••••••••••••••••• 25
2.2.2 質體轉化 (transformation) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
2.2.3 質體DNA的製備 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
2.2.4 質體DNA正確性之確認 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
2.3 豬胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於活體外 (in vitro)之表現 28
2.3.1 豬腎細胞 (LLC-PK1)與大腸桿菌 (TOP10)之培養 ••••••••••••••••• 28
2.3.1.1 豬腎細胞 (LLC-PK1) 之培養 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
2.3.1.2 大腸桿菌 (TOP10)之培養 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
2.3.2 細胞轉染 (transfection) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
2.3.3 硫酸十二酯鈉多醯胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) •••••••••••••••••••••••• 29
2.3.3.1 蛋白質樣本製備 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
2.3.3.2 製作硫酸十二酯鈉多醯胺凝膠 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 30
2.3.4 西方點墨法 (Western blot) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
2.4 DNA疫苗之動物試驗 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 32
2.4.1 實驗動物 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 32
2.4.2 疫苗免疫策略 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 32
2.4.3 血清檢體製備 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33
2.4.4 酵素連結免疫吸附法 (ELISA) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33
2.4.5 攻毒試驗 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 35
第三章 結果 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
3.1 豬胸膜肺炎放線桿菌菌體培養 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
3.2 豬胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因之選殖 •••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
3.3 豬胸膜肺炎放線桿菌目標抗原基因之建構 •••••••••••••••••••••••••••••••••• 37
3.4 豬胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於活體外 (in vitro)之表現 38
3.4.1 豬胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於大腸桿菌 (TOP10)之表現 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 38
3.4.2 豬胸膜肺炎放線桿菌抗原基因質體於豬腎細胞 (LLC-PK1)之表現 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39
3.5 豬胸膜肺炎放線桿菌DNA疫苗所誘發之免疫反應 •••••••••••••••••••• 39
3.5.1 抗體反應 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 39
3.5.2 豬胸膜肺炎放線桿菌DNA疫苗對小鼠抵抗攻毒之保護效果••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 40
圖表 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 42
第四章 討論 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 64
第五章 參考文獻 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 70

徐興鎔, 翁仲男, 周凝元, 金約翰, 韓海倫 (1976) 豬嗜血桿菌肺炎在台灣之流行報告. 64/65年期研究試驗報告, pp. 191-197: 台糖公司畜產研究所.

Ajito, T., Haga, Y., Homma, S., Goryo, M. and Okada, K. (1996) Immunohistological evaluation on respiratory lesions of pigs intranasally inoculated with Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. J. Vet. Med. Sci. 58, 297-303.

Andresen, L. O., Jacobsen, M. J. and Nielsen, J. P. (1997) Experimental vaccination of pigs with an Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5b capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugate. Acta. Vet. Scand. 38, 283-293.

Bagdasarian, M. M., Nagai, M., Frey, J. and Bagdasarian, M. (1999) Immunogenicity of Actinobacillus ApxIA toxin epitopes fused to the E. coli heat-labile enterotoxin B subunit. Vaccine. 17, 441-447.

Baltes, N., Hennig-Pauka, I. and Gerlach, G. F. (2002) Both transferrin binding proteins are virulence factors in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 7 infection. FEMS. Microbiol. Lett. 209, 283-287.

Beck, M., Van den Bosch, J. F., Jongenelen, I. M. C. A., Loeffen, P. L. W., Nielsen, R., Nicolet, J. and Frey, J. (1994) RTX toxin genotypes and phenotypes in Actinobacillus pleuropneumoniae field strains. J. Clin. Microbiol. 32, 2749-2754.

Belanger, M., Debreuil, D., Harel, J., Girard, C. and Jacques, M. (1990) Role of lipopolysaccharides in adherence of Actinobacillus pleuropneumoniae to porcine tracheal rings. Infect. Immun. 58, 3523-3530.


Blackall, P. J., Klaasen, H. L. B. M., Van Den Bosch, H., Kuhnert, P. and Frey, J. (2002) Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: Serovar 15. Vet. Microbiol. 84, 47-52.

Boekema, B. K. H. L., Kamp, E. M., Smits, M. A., Smith, H. E. and Stockhofe-Zurwieden, N. (2004) Both ApxI and ApxII of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 are necessary for full virulence. Vet. Microbiol. 100, 17-23.

Bosse, J. T., Janson, H., Sheehan, B. J., Beddek, A. J., Rycroft, A. N., Kroll, J. S. and Langford, P. R. (2002) Actinobacillus pleuropneumoniae: Pathobiology and pathogenesis of infection. Microbes. Infect. 4, 225-235.

Cho, W. S. and Chae, C. (2001) Genotypic prevalence of apxIV in Actinobacillus pleuropneumoniae field isolates. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 175-177.

Corr, M., Lee, D. J., Carson, D. A. and Tighe, H. (1996) Gene vaccination with naked plasmid DNA: Mechanism of CTL priming. J. Exp. Med. 184, 1555-1560.

Cruijsen, T., Van Leengoed, L. A. M. G., Ham-Hoffies, M. and Verheijden, J. H. M. (1995) Convalescent pigs are protected completely against infection with a homologous Actinobacillus pleuropneumoniae strain but incompletely against a heterologous-serotype strain. Infect. Immun. 63, 2341-2343.

D'Silva, C. G., Archibald, F. S. and Niven, D. F. (1995) Comparative study of iron acquisition by biotype 1 and biotype 2 strains of Actinobacillus pleuropneumoniae. Vet. Microbiol. 44, 11-23.

Daban, M., Medrano, A. and Querol, E. (1996) Cloning, sequencing and expression of the transferrin-binding protein 1 gene from Actinobacillus pleuropneumoniae. Biochem. J. 315, 257-264.



Del Rio, M. L., Navas, J., Martin, A. J., Gutierrez, C. B., Rodriguez-Barbosa, J. I. and Rodriguez Ferri, E. F. (2006) Molecular characterization of Haemophilus parasuis ferric hydroxamate uptake (fhu) genes and constitutive expression of the FhuA receptor. Vet. Res. 37, 49-59.

Dom, P., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. and Charlier, G. (1994) In vivo association of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 with the respiratory epithelium of pigs. Infect. Immun. 62, 1262-1267.

Duff, J. P., Scott, W. A., Wilkes, M. K. and Hunt, B. (1996) Otitis in a weaned pig: A new pathological role for Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae. Vet. Rec. 139, 561-563.

Frey, J. and Nicolet, J. (1988a) Regulation of hemolysin expression in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 by Ca2+. Infect. Immun. 56, 2570-2575.

Frey, J. and Nicolet, J. (1988b) Purification and partial characterization of a hemolysin produced by Actinobacillus pleuropneumoniae type strain 4074. FEMS. Microbiol. Lett. 55, 41-46.

Frey, J., Van den Bosch, H., Segers, R. and Nicolet, J. (1992) Identification of a second hemolysin (HlyII) in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 and expression of the gene in Escherichia coli. Infect. Immun. 60, 1671-1676.

Frey, J., Beck, M., Stucki, U. and Nicolet, J. (1993a) Analysis of hemolysin operons in Actinobacillus pleuropneumoniae. Gene. 123, 51-58.

Frey, J., Bosse, J. T., Chang, Y. F., Cullen, J. M., Fenwick, B., Gerlach, G. F., Gygi, D., Haesebrouck, F., Inzana, T. J., Jansen, R., Kamp, E. M., MacDonald, J., MacInnes, J. I., Mittal, K. R., Nicolet, J., Rycroft, A. N., Segers, R. P. A. M., Smits, M. A., Stenbaek, E. (1993b) Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxins: Uniform designation of haemolysins, cytolysins, pleurotoxin and their genes. J. Gen. Microbiol. 139, 1723-1728.


Frey, J., Haldimann, A., Nicolet, J., Boffini, A. and Prentki, P. (1994) Sequence analysis and transcription of the apxI operon (hemolysin I) from Actinobacillus pleuropneumoniae. Gene. 142, 97-102.

Frey, J. (1995) Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins. Trends. Microbiol. 3, 257-260.

Gauldie, J., Richards, C., Harnish, D., Lansdorp, P. and Baumann, H. (1987) Interferon beta 2/B-cell stimulatory factor type 2 shares identity with monocyte-derived hepatocyte-stimulating factor and regulates the major acute phase protein response in liver cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 7251-7255.

Gerlach, G. F., Anderson, C., Potter, A. A., Klashinsky, S. and Willson, P. J. (1992) Cloning and expression of a transferrin-binding protein from Actinobacillus pleuropneumoniae. Infect. Immun. 60, 892-898.

Gerlach, G. F., Anderson, C., Klashinsky, S., Rossi-Campos, A., Potter, A. A. and Willson, P. J. (1993) Molecular characterization of a protective outer membrane lipoprotein (OmlA) from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Infect. Immun. 61, 565-572.

Glasspool-Malone, J., Somiari, S., Drabick, J. J. and Malone, R. W. (2000) Efficient nonviral cutaneous transfection. Mol. Ther. 2, 140-146.



Gonzalez, G. C., Yu, R. H., Rosteck Jr, P. R. and Schryvers, A. B. (1995) Sequence, genetic analysis, and expression of Actinobacillus pleuropneumoniae transferrin receptor genes. Microbiology. 141, 2405-2416.

Gurunathan, S., Klinman, D. M. and Seder, R. A. (2000a) DNA vaccines: Immunology, application, and optimization. Annu. Rev. Immunol. 18, 927-974.



Gurunathan, S., Wu, C. Y., Freidag, B. L. and Seder, R. A. (2000b) DNA vaccines: A key for inducing long-term cellular immunity. Curr. Opin. Immunol. 12, 442-447.

Gygi, D., Nicolet, J., Frey, J., Cross, M., Koronakis, V. and Hughes, C. (1990) Isolation of the Actinobacillus pleuropneumoniae haemolysin gene and the activation and secretion of the prohaemolysin by the HlyC, HlyB and HlyD proteins of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 4, 123-128.

Gygi, D., Nicolet, J., Hughes, C. and Frey, J. (1992) Functional analysis of the Ca2+-regulated hemolysin I operon of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Infect. Immun. 60, 3059-3064.

Hensel, A., Windt, H., Stockhofe-Zurwieden, N., Lodding, H., Koch, W. and Petzoldt, K. (1993) A porcine aerosol infection model for studying dose dependent effects caused by Actinobacillus pleuropneumoniae bacteria. J. Aerosol. Med. 6, 73-88.

Hirano, T., Yasukawa, K. and Harada, H. (1986) Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature. 324, 73-76.

Ikebuchi, K., Wong, G. G., Clark, S. C., Ihle, J. N., Hirai, Y. and Ogawa, M. (1987) Interleukin 6 enhancement of interleukin 3-dependent proliferation of multipotential hemopoietic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 9035-9039.

Ishibashi, T., Kimura, H., Uchida, T., Kariyone, S., Friese, P. and Burstein, S. A. (1989) Human interleukin 6 is a direct promoter of maturation of megakaryocytes in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 5953-5957.

Iwasaki, A., Torres, C. A., Ohashi, P. S., Robinson, H. L. and Barber, B. H. (1997) The dominant role of bone marrow-derived cells in CTL induction following plasmid DNA immunization at different sites. J. Immunol. 159, 11-14.

Jacques, M. (1996) Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends. Microbiol. 4, 408-410.

Jacques, M. and Paradis, S. E. (1998) Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS. Microbiol. Rev. 22, 45-59.

Jobert, J. L., Savoye, C., Cariolet, R., Kobisch, M. and Madec, F. (2000) Experimental aerosol transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae to pigs. Can. J. Vet. Res. 64, 21-26.

Kamp, E. M., Popma, J. K., Anakotta, J. and Smits, M. A. (1991) Identification of hemolytic and cytotoxic proteins of Actinobacillus pleuropneumoniae by use of monoclonal antibodies. Infect. Immun. 59, 3079-3085.

Kamp, E. M., Vermeulen, T. M. M., Smits, M. A. and Haagsma, J. (1994) Production of Apx toxins by field strains of Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus suis. Infect. Immun. 62, 4063-4065.


Klinman, D. M., Sechler, J. M. G., Conover, J., Gu, M. and Rosenberg, A. S. (1998) Contribution of cells at the site of DNA vaccination to the generation of antigen-specific immunity and memory. J. Immunol. 160, 2388-2392.

Lechtenberg, K. F., Shryock, T. R. and Moore, G. (1994) Characterization of an Actinobacillus pleuropneumoniae seeder pig challenge-exposure model. Am. J. Vet. Res. 55, 1703-1709.

Liao, C. W., Chiou, H. Y., Yeh, K. S., Chen, J. R. and Weng, C. N. (2003) Oral immunization using formalin-inactivated Actinobacillus pleuropneumoniae antigens entrapped in microspheres with aqueous dispersion polymers prepared using a co-spray drying process. Prev. Vet. Med. 61, 1-15.

Liggett, A. D., Harrison, L. R. and Farrell, R. L. (1987) Sequential study of lesion development in experimental Haemophilus pleuropneumonia. Res. Vet. Sci. 42, 204-212.

Macdonald, J. and Rycroft, A. N. (1992) Molecular cloning and expression of ptxA, the gene encoding the 120- kilodalton cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2. Infect. Immun. 60, 2726-2732.

Mikael, L. G., Pawelek, P. D., Labrie, J., Sirois, M., Coulton, J. W. and Jacques, M. (2002) Molecular cloning and characterization of the ferric hydroxamate uptake (fhu) operon in Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology. 148, 2869-2882.

Niven, D. F. and Levesque, M. (1988) V-factor-dependent growth of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 (Bertschinger 2008/76). Int. J. Syst. Bacteriol. 38, 319-320.

Park, S. M., Choi, E. J., Kwon, T. H., Jang, Y. S., Yoo, H. S., Choi, W. B., Park, B. K. and Kim, D. H. (2005) Expression of the Apx toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae in Saccharomyces cerevisiae and its induction of immune response in mice. Biotechnol. Bioprecess Eng. 10, 362-366.

Perry, M. B., Altman, E., Brisson, J. R., Beynon, L. M. and Richards, J. C. (1990) Structural characteristics of the antigenic capsular polysaccharides and lipopolysaccharides involved in the serological classification of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae strains. Serodiagn. Immunother. Infect. Dis. 4, 299-308.

Pohl, S., Bertschinger, H. U., Frederiksen, W. and Mannheim, W. (1983) Transfer of Haemophilus pleuropneumoniae and the Pasteurella haemolytica-like organism causing porcine necrotic pleuropneumonia to the genus Actinobacillus (Actinobacillus pleuropneumoniae comb. nov.) on the basis of phenotypic and deoxyribonucleic acid relatedness. Int. J. Syst. Bacteriol. 33, 510-514.

Ramjeet, M., Deslandes, V., St. Michael, F., Cox, A. D., Kobisch, M., Gottschalk, M. and Jacques, M. (2005) Truncation of the lipopolysaccharide outer core affects susceptibility to antimicrobial peptides and virulence of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. J. Biol. Chem. 280, 39104-39114.

Rioux, S., Girard, C., Dubreuil, J. D. and Jacques, M. (1998) Evaluation of the protective efficacy of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 detoxified lipopolysaccharides or O-polysaccharide-protein conjugate in pigs. Res. Vet. Sci. 65, 165-167.

Rogers, R. J., Eaves, L. E., Blackall, P. J. and Truman, K. F. (1990) The comparative pathogenicity of four serovars of Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae. Aust. Vet. J. 67, 9-12.

Rose, T., Sebo, P., Bellalou, J. and Ladant, D. (1995) Interaction of calcium with Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin. Characterization of multiple calcium-binding sites and calcium-induced conformational changes. J. Biol. Chem. 270, 26370-26376.

Rosendal, S., Boyd, D. A. and Gilbride, K. A. (1985) Comparative virulence of porcine Haemophilus bacteria. Can. J. Comp. Med. 49, 68-74.

Rycroft, A. N., Wiliams, D., Cullen, J. M. and MacDonald, J. (1991) The cytotoxin of Actinobacillus pleuropneumoniae (pleurotoxin) is distinct from the haemolysin and is associated with a 120 kDa polypeptide. J. Gen. Microbiol. 137, 561-568.

Sato, Y., Roman, M., Tighe, H. and other authors (1996) Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science. 273, 352-354.

Sauer, F. G., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Martinez, J. J. and Hultgren, S. J. (2000) Bacterial pili: Molecular mechanisms of pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 3, 65-72.

Schaller, A., Kuhn, R., Kuhnert, P., Nicolet, J., Anderson, T. J., MacInnes, J. I., Segers, R. P. A. M. and Frey, J. (1999) Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology. 145, 2105-2116.




Schaller, A., Djordjevic, S. P., Eamens, G. J., Forbes, W. A., Kuhn, R., Kuhnert, P., Gottschalk, M., Nicolet, J. and Frey, J. (2001) Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxIVA. Vet. Microbiol. 79, 47-62.

Seah, J. N., Frey, J. and Kwang, J. (2002) The N-terminal domain of RTX toxin ApxI of Actinobacillus pleuropneumoniae elicits protective immunity in mice. Infect. Immun. 70, 6464-6467.


Sebunya, T. N. K., Saunders, J. R. and Osborne, A. D. (1983) Dose response relationship of Haemophilus pleuropneumoniae aerosols in pigs. Can. J. Comp. Med. 47, 54-56.

Shin, S. J., Bae, J. L., Cho, Y. W., Lee, D. Y., Kim, D. H., Yang, M. S., Jang, Y. S. and Yoo, H. S. (2005) Induction of antigen-specific immune responses by oral vaccination with Saccharomyces cerevisiae expressing Actinobacillus pleuropneumoniae ApxIIA. FEMS. Immunol. Med. Microbiol. 43, 155-164.

Sidibe, M., Messier, S., Lariviere, S., Gottschalk, M. and Mittal, K. R. (1993) Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine upper respiratory tract as a complement to serological tests. Can. J. Vet. Res. 57, 204-208.

Srikumar, R., Mikael, L. G., Pawelek, P. D., Khamessan, A., Gibbs, B. F., Jacques, M. and Coulton, J. W. (2004) Molecular cloning of haemoglobin-binding protein HgbA in the outer membrane of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology. 150, 1723-1734.

Taylor, D. J. (1999) Actinobacillus pleuropneumoniae. In Diseases of Swine (Shaw, B.E. D’Allaire, S. Mengeling, W.L. Taylor, D.J.), pp. 343-354. Blackwell Science., Oxford.

Torremorell, M., Pijoan, C., Janni, K., Walker, R. and Joo, H. S. (1997) Airborne transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in nursery pigs. Am. J. Vet. Res. 58, 828-832.

Tosato, G. and Pike, S. E. (1988) Interferon-beta2/interleukin 6 is a co-stimulant for human T lymphocytes. J. Immunol. 141, 1556-1562.

Ulmer, J. B., Donnelly, J. J., Parker, S. E. and other authors (1993) Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science. 259, 1745-1749.


Van Damme, J., Van Beeumen, J., Decock, B., Van Snick, J., De Ley, M. and Billiau, A. (1988) Separation and comparison of two monokines with lymphocyte-activating factor activity: IL-1? and hybridoma growth factor (HGF). Identification of leukocyte-derived HGF as IL-6. J. Immunol. 140, 1534-1541.

Van Snick, J. (1990) Interleukin-6: An overview. Annu. Rev. Immunol. 8, 253-278.

Wilke, M., Franz, B. and Gerlach, G. F. (1997) Characterization of a Large Transferrin-binding Protein from Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 7. Zentralbl. Veterinarmed. B 44, 73-86.

Wolff, J. A., Malone, R. W., Williams, P., Wang, C., Acsadi, G., Jani, A. and Felgner, P. L. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247, 1465-1468.

Wooldridge, J. E., Ballas, Z., Krieg, A. M. and Weiner, G. J. (1997) Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing CpG motifs enhance the efficacy of monoclonal antibody therapy of lymphoma. Blood. 89, 2994-2998.

Zhang, Y., Tennent, J. M., Ingham, A., Beddome, G., Prideaux, C. and Michalski, W. P. (2000) Identification of type 4 fimbriae in Actinobacillus pleuropneumoniae. FEMS. Microbiol. Lett. 189, 15-18.