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研究生:賴儀倩
研究生(外文):Yi-Chien Lai
論文名稱:高濃度葡萄糖對人類肝癌細胞之凝血及抗凝血因子基因表現之影響
論文名稱(外文):Effect of high glucose concentration on expression of coagulation and anticoagulation factors in Hep G2 cells
指導教授:詹恭巨詹恭巨引用關係
指導教授(外文):Kung-Chi Chan
學位類別:碩士
校院名稱:靜宜大學
系所名稱:食品營養研究所
學門:醫藥衛生學門
學類:營養學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2006/07/
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:110
中文關鍵詞:抗凝血&抗凝血&抗凝血&抗凝血&抗凝血&抗凝血&
外文關鍵詞:Antithrombin IIIHepG2 cellshyperglycemiaFactor VII
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研究指出糖尿病患者主要死於血栓性疾病,而造成糖尿病凝血作用異常的主要原因為高糖濃度所誘發產生之自由基及代謝紊亂,導致細胞內之氧化損傷、糖化作用及訊號傳遞的改變。臨床研究顯示糖尿病患者有較高之凝血活性,而有較低之抗凝及纖溶活性,導致體內趨向促凝之狀態。然而,高糖環境如何影響凝血作用之機制則未有進一步的研究。因此,本研究目的以人類肝癌細胞(HepG2 cells)培養於高濃度葡萄糖之模式下,觀察對凝血及抗凝血因子之分泌量及活性的影響,並探討可能的機轉。本研究分兩階段進行,第一階段實驗之目的在於確定適合之高葡萄糖濃度。將HepG2 細胞分別培養於不同葡萄糖濃度(25~65mM)及對照組之不同滲透壓濃度(619~659mOsm/L)的培養液中,分別於4、6、8、10及12天,以MTT試驗檢測細胞之存活率及脂質過氧化物(MDA)之產量。結果顯示,能與正常葡萄糖濃度(25mM)有相近之生長狀態,並且能顯著誘發脂質過氧化作用的高糖濃度為45mM。第二階段則是將HepG2 細胞分別培養於對照組(25mM glucose)與高糖組(45mM glucose)之DMEM培養液10天後,收集細胞進行計數及蛋白激C活性之測定,而培養液則測定總蛋白質、MDA、C-反應蛋白之濃度與凝血因子VII、抗凝血III之分泌量及其活性。結果顯示,高糖組培養10天後其MDA含量、蛋白激C及凝血因子VII之活性皆顯著增加(p < 0.05),抗凝血III之活性則明顯降低;高糖濃度會抑制凝血因子VII的表現,但對抗凝血III的表現則不影響。綜合上述,HepG2 細胞暴露於高濃度葡萄糖環境下會顯著誘發脂質過氧化作用,而凝血及抗凝血因子活性及蛋白質表現量的改變,可能受到糖化作用及蛋白激C所媒介的後轉譯路徑之調控。
More than 80% diabetic patients die from a thrombotic cardiovascular event, and hyperglycemia-induced oxidative damage may play an important role in the pathogenesis of thrombotic diseases. Studies from clinical trials reported that diabetic patients have abnormal activity of blood coagulation, however, the mechanism of how hyperglycemia affects coagulation cascade is still unclear. Therefore, the purpose of this study was to investigate the effect of high glucose concentration on the expression of coagulation and anticoagulation factor in HepG2 cells. In the 1st study, high glucose concentration was first determined for the subsequent experiment. HepG2 cells were incubated under different glucose (25~65mM) and osmotic (619~659 mOsm/L) concentrations in the medium for 4, 6, 8, 10 and 12 consecutive days, and cells survival rate was measured by the MTT assay. Malondialdehyde (MDA) concentration also was measured by TBA assay at 10th day of incubation. The results of the 1st study showed that HepG2 cells incubated at 45mM glucose concentration have similar growth curve with cells incubated under normal glucose concentration(25mM). However, MDA production was significantly increased in cells with high glucose concentration. In the 2nd experiment, HepG2 cells were incubated under 25mM glucose (control) and 45mM glucose in DMEM medium. After 10 days of incubation, cell survival and protein kinase C (PKC) activity of cell lysate, total protein, content of incubating medium, MDA, C-reactive protein (CRP), activity and concentration of Factor VII and antithrombin III (AT-III) were measured. The results of 2nd study showed that MDA production was induced significantly by high glucose (45mM) concentration. Activities of PKC and Factor VII were increased, and AT-III activity was decreased (p&lt;0.05) under high glucose treatment. High glucose concentration inhibited Factor VII expression, but had no effect on AT-III secretion in HepG2 cells. In conclusion, hyperglycemia-induced lipid peroxidation and altered PKC activity may involved in the posttranslational regulation of abnormal activity of factor VII and AT-III.
目錄 …………………………………………………………………I
表目錄 ………………………………………………………………VI
圖目錄 ………………………………………………………………VII
名詞縮寫 ……………………………………………………………IX
中文摘要 ……………………………………………………………X
英文摘要 ……………………………………………………………XI

第一章 緒言............................................ 1

第二章 文獻回顧 ....................................... 2
第一節 糖尿病簡介 ................................... 2
一、糖尿病之成因 ...................................2
二、糖尿病之診斷標準 .............................. 3
三、糖尿病之分類 .................................. 4
四、糖尿病之流行病學............................... 4
(一) 糖尿病併發症之盛行率......................... 5
(二) 糖尿病併發心血管疾病之盛行率 ................ 6
第二節 糖尿病併發血栓性心血管疾病之病理機制 ......... 7
第三節 糖尿病與心血管疾病因子之相關性................ 8
一、高糖對C-反應蛋白濃度之影響 .................... 8
(一) C-反應蛋白之簡介............................. 8
(二) 心血管疾病與C-反應蛋白 ...................... 9
(三) 糖尿病與C-反應蛋白 .......................... 9
二、高糖對蛋白激酶C 活性之影響 .................... 10
(一) 蛋白激酶C 的分類及結構 ...................... 10
(二) 蛋白激酶C 之活化因子DAG 的生成路徑 .......... 11
(三) 高糖與蛋白激酶C.............................. 13
(四) 激活蛋白激酶C 之影響 ........................ 14
三、高糖對凝血反應之影響 .......................... 15
(一) 凝血反應途徑 ................................ 15
(二) 糖尿病之高凝狀態 ............................ 19
第四節 高糖與氧化緊迫 ............................... 20
一、高糖誘發自由基之生成機制 ...................... 20
二、高糖誘發自由基之損傷機制 ...................... 22
(一) 對核酸之氧化損傷 ........................... 22
(二) 對脂質和細胞膜之氧化損傷 ................... 22
(三) 對蛋白質之氧化損傷 ......................... 23
(四) 對葡萄糖代謝之氧化損傷 ..................... 24
第五節 人類肝癌細胞(HepG2 cells)簡介 ................ 25
一、人類肝癌細胞之分類 ............................ 25
二、HepG2 細胞之生化特性 .......................... 25
三、HepG2 細胞之相關應用 .......................... 26
四、HepG2 細胞之凝血相關研究 ...................... 26
第六節 研究目的 ..................................... 27

第三章 材料與方法 ..................................... 28
第一節 材料 ......................................... 28
一、試藥及試劑組................................... 28
二、重要儀器 ...................................... 30
三、細胞來源 ...................................... 30
第二節 試驗設計 ..................................... 30
第三節 實驗分析方法 ................................. 32
一、細胞培養 ....................................... 32
(一) 培養液之製備 ................................. 32
(二) 活化細胞 ..................................... 32
(三) 繼代細胞 ..................................... 32
(四) 凍細胞 ....................................... 33
二、細胞存活率分析(MTT assay)....................... 33
(一) 分析細胞數目與MTT 分析法吸光數值之相關性 ..... 34
(二) 分析不同濃度葡萄糖及滲透濃度對細胞存活率之影響.34
三、實驗分析檢體之製備 ............................. 36
(ㄧ) 濃縮細胞培養液之製備 ......................... 36
(二) 細胞均質液之製備 ............................. 36
四、錐藍排除分析 ................................... 37
五、總蛋白質含量之測定 ..............................37
六、丙二醛含量之測定................................ 38
七、凝血因子VII 活性之測定 ......................... 38
八、抗凝血酶III 活性之測定 ......................... 39
九、凝血因子VII 分泌量之測定 ....................... 40
十、抗凝血酶III 分泌量之測定 ....................... 40
十一、C-反應蛋白分泌量之測定 ....................... 41
十二、蛋白質激酶C 活性之測定 ....................... 42
第四節 統計分析 ..................................... 43

第四章 結果與討論 ..................................... 44
第一階段 ............................................. 44
第一節 以MTT 試驗評估不同濃度葡萄糖及滲透濃度對HepG2細
胞存活率之影響................................. 44
一、評估HepG2 細胞數目與MTT 試驗吸光值之相關性 ..... 44
二、評估不同濃度葡萄糖對HepG2 細胞存活率之影響 ..... 45
三、評估不同滲透濃度對HepG2 細胞存活率之影響 ....... 45
第二節 以MDA 濃度評估不同濃度葡萄糖及滲透濃度對HepG2細
胞脂質過氧化之影響 ............................ 46
一、評估不同濃度葡萄糖誘發HepG2細胞脂質過氧化之影響..46
二、評估不同滲透濃度誘發HepG2 細胞脂質過氧化之影響...46

第二階段 ...............................................47
第三節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2活細胞數目及總蛋白質分
泌量之影響 .....................................47
第四節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2細胞脂質過氧化物之影響.48
第五節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2細胞之C-反應蛋白分泌量
之影響..........................................49
第六節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2細胞之凝血因子VII活性
及分泌量之影響................................. 51
第七節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2細胞之抗凝血III活性
及分泌量之影響 .................................54
第八節 高濃度葡萄糖(45mM)對HepG2細胞之蛋白激C活性之
影響 ...........................................56

第五章 結論 ........................................... 73
參考文獻............................................... 74
附錄一、凝血反應途徑 .................................. 94
附錄二、人類肝癌細胞株的來源與特性 .................... 95
附錄三、人類肝癌細胞株之主要分泌的血漿蛋白 ............ 96
附錄四、應用HepG2 細胞之相關代謝研究 .................. 97
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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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