臺灣博碩士論文加值系統

本實驗使用新鮮的喜樹葉，以乙醇與氫氧化鈉溶液萃取等兩種方法，來探討萃取與純化喜樹葉中喜樹鹼最佳化條件。喜樹葉中喜樹鹼含量會因季節變化而改變，所以最佳採收喜樹葉的時間為每年的5月至10月，其中以7、8月份的喜樹鹼含量為最多。喜樹葉的萃取方面，可以選用10倍體積的95%酒精溶液萃取24小時，或是選用10倍體積的50 mM氫氧化鈉溶液萃取24小時，再以稀鹽酸調整pH值為5.5靜置24小時。在液相萃取方面，兩種粗萃液都選用二氯甲烷來分離極性物質，選用的比例分別為酒精粗萃物：二氯甲烷=1：1，而NaOH粗萃物：二氯甲烷=1：2為最佳。在管柱層析方面，自行充填Silica gel為固定相，移動相比例為甲醇：二氯甲烷=1：10，有效去除非極性物質，增加喜樹鹼的純度。如果每克新鮮喜樹葉中含有喜樹鹼1毫克，經過酒精萃取和純化的步驟後，可以得到0.54毫克的喜樹鹼，純度為69.95%；經過NaOH萃取和純化的步驟後，可以得到0.49毫克的喜樹鹼，純度為75.36%。

Two processes of campothecin (CPT) extraction from fresh leaves of Camptotheca acuminate by alcohol and NaOH solution was developed and compared. The fresh leaves of C. acuminate were either extracted by 10 ml/g of 95% alcohol at 25℃ for 24 hours or extracted by 50 mM NaOH solution at 25℃ for 24 hours followed by adjusting pH value to 5.5 for another 24 hours. The extracts were then subjected to liquid – liquid extraction by uaing CH2Cl2 as extraction for the separation of CPT from other residues. Finally, a patition column filled with silica gel was used to further isolate CPT. In conclusions, if 1 g of C. acuminate leaves contained 1 mg of CPT, 0.54 mg CPT can be obtained with 69.95% purity from the alcohol extraction process while 0.49 mg of CPT with 75.39% purity would be obtained from the NaOH extraction process.

目錄
中文摘要…………………………………………………………………. I
英文摘要………………………………………………………..................II
致謝……………………………………………………………………….III
目錄……………………………………………………………………….IV
表目錄…………………………………………………………………..VIII
圖目錄…………………………………………………………………….IX
一、 緒論………………………………………………………………….1
二、 文獻回顧…………………………………………………………….2
2.1 喜樹……………………………………………………………………………..2
2.1.1 基礎研究…………………...……………………………………………..2
2.1.2 栽培技術………………….………………………………………………3
2.1.3 採葉技術……………………………………………………………….…4
2.1.4 組織培養……………………………………………………………….…4
2.1.5 喜樹中所含的生物活性成分………………………………………….…5
2.1.6 喜樹中喜樹鹼的累積………………………………………………….…6
2.2 喜樹鹼………………………………………………………………….……….7
2.2.1 研究歷史……………………………………………………….…………7
2.2.2 抗癌作用機轉………………………………………………….…………9
2.2.3 物化性質……………………………………………………….…………9
2.2.4 結構改變之影響………………………………………...…….………...10
2.2.5 藥理作用及其毒性……………………………………….......................10
2.2.6 臨床上的應用……………………………….……………......................11
2.2.7 喜樹鹼在體內代謝之情形………………….……………......................12
2.2.8 含有喜樹鹼及其類似物的其他植物……...………………....................14
2.2.9 喜樹鹼之生物合成路徑………………….………………......................14
2.3 純化喜樹鹼之相關研究……………….……………………….......................19
2.3.1 鹼水萃取………………….……………………………………………..20
2.3.2 酸水萃取………………….……………………………………………..22
2.3.3 酒精萃取………………….……………………………………………..23
2.2.4 管柱層析與分離………….……………………………………………..23
2.2.5 樹酯吸附層析…………….……………………………………………..23
2.4 管柱層析理論……………………..…………………………………………..24
2.4.1 正相/逆相分離機制………………………………………….………….24
2.4.2 製備級液相層析的操作模式……………………………….…………..26
三、材料與方法………………………………………………………….28
3.1 實驗材料………………………….…………………………………………...28
3.1.1 儀器設備………………….……………………………………………..28
3.1.2 實驗藥品………………….……………………………………………..29
3.1.3 喜樹葉…………………….………………………..................................30
3.2 實驗方法……………….……………………………………………………...30
3.2.1 HPLC分析方法的建立…………………………….……………………30
3.2.1.1 UV偵測波長的選擇……………………………….…………….30
3.2.1.2 HPLC移動相條件的選擇………………………….……………31
3.2.1.3 檢量線的繪製………………………………….………………..32
3.2.2 喜樹鹼的萃取…………………….……………………………………..33
3.2.2.1 喜樹葉中喜樹鹼的含量分析……….………………..................33
3.2.2.2 酒精粗萃喜樹葉的條件選擇…………………….……………..33
3.2.2.3 鹼法粗萃喜樹葉的條件選擇………………….………………..35
3.2.2.4 液相萃取分離……………………….…………………………..36
3.2.3 喜樹鹼的分離………………………….………………………………..37
3.2.3.1 管柱層析………………………….……………………………..37
3.2.3.2 薄層層析………………….……………………………………..37
3.2.3.3 再結晶……………….…………………………………………..38
四、結果與討論………………………………………………………….40
4.1 分析方法之建立…………………….…………………………………...……40
4.1.1 分析最適波長的選擇…………………….……………………………..40
4.1.2 HPLC移動相條件的選擇…………………………….…………………41
4.1.3 檢量線的繪製…………………….……………………………………..44
4.2 喜樹鹼的萃取……………….………………………………………………..48
4.2.1 喜樹葉中喜樹鹼的含量分析…………………….……………………..48
4.2.2 不同萃取溶劑對喜樹鹼萃取量的影響………...……………………..50
4.2.3 酒精萃取………………………………………….……………………..51
4.2.3.1 酒精萃取體積對喜樹鹼萃取量的影響………..….……………51
4.2.3.2 酒精萃取時間與溫度對喜樹鹼萃取量的影響…..…………….52
4.2.3.3 不同酒精萃取濃度對喜樹鹼萃取量的影響…………………...53
4.2.3.4 不同比例的二氯甲烷對分離酒精萃液的影響……….………..54
4.2.4 鹼法萃取…………………….…………………………………………..56
4.2.4.1 不同濃度鹼法萃取對喜樹鹼萃取量的影響…….……………..56
4.2.4.2 鹼法萃取溫度與時間對喜樹鹼萃取量的影響………………...57
4.2.4.3 鹼法閉環反應時pH值對喜樹鹼萃取量的影響………….……58
4.2.4.4 不同比例的二氯甲烷對分離鹼法萃液的影響………………...59
4.2.5 薄層層析對分離喜樹鹼的影響…………….…………………………..60
4.2.6 管柱層析對分離喜樹鹼之影響……………….………………………..63
4.2.7 再結晶…………………………………………………………….……..64
4.2.8 利用photodiarray來鑑別喜樹鹼………………………………………..65
4.2.9 實驗流程和喜樹鹼純度與回收率變化………………………………...69
五、結論…………………………………………………………………..71
六、參考文獻……………………………………………………………..72
表3.1-1 實驗藥品……………………………………………..................29
表4.1-1 喜樹鹼標準品濃度與面積…………………………………………………..45
表4.1-2 破環喜樹鹼標準品濃度與面積…………………………..…………………47
表4.2-1 每次萃取所佔的百分比……………………………………………………..48
表4.2-2 酒精萃取後液相分離後二氯甲烷層溶液的濃度………..…………………55
表4.2-3 酒精萃取後液相分離二氯甲烷層的純度與回收率………..………………55
表4.2-4 鹼法萃取後液相分離後二氯甲烷層溶液的濃度…………..………………59
表4.2-5 鹼法萃取後液相分離二氯甲烷層的回收率與純度………..………………60
表4.2-6 二氯甲烷分液萃取後在薄層層析後的雜質之Rf值………...……………..61
表4.2-7 二氯甲烷分液萃取後在薄層層析後的雜質之Rf值…………………….…61
表4.2-8 二氯甲烷分液萃取後在薄層層析後的雜質之Rf值……………………….62
表4.2-9 管柱層析前後的濃度與溶液體積…………………………………………..63
表4.2-10 管柱層析前後乾燥後溶液的總重與溶液中喜樹鹼的總重………………63
表4.2-11 管柱層析後的純度與回收率……………………………………………….64
圖2.1-1 喜樹鹼結構圖……………………………………………………………….5
圖2.2-1 喜樹鹼及其衍生物的化學結構式……………………………………………8
圖2.2-2 喜樹鹼從lactone form會被鹼破環形成carboxyl form…………………13
圖2.2-3 ﹝1-13C﹞Glucose 的糖解作用……………………………..……………….15
圖2.2-4 IPP 和 dimethylallyl diphosphate (DMAPP) 的形成是經由 the MVA
pathway (A) 或 the MEP pathway (B)……………………………………..16
圖2.2-5 Tryptamine 的生物合成途徑是從 [1,6-13C]Glucose 6-phosphate 經由
the shikimate pathway而得的……………………………………………….17
圖2.2-6 喜樹檢的生物合成是由﹝1-13C﹞Glc.而來。圓點(●)的13C是﹝1-13C﹞
Glc.經由MEP pathway………………………………………………………18
圖2.3-1 Camptotheca acuminata 的分餾法…………………………………………..20
圖2.3-2 利用HPLC分離carboxylate/lactone form的喜樹鹼………………………..21
圖2.3-3 在磷酸緩衝溶液下，不同pH值下形成C-HCPT與O-HCPT的相對比
例……………22
圖2.4-1 矽膠鍵結直鏈…………………………………………………….………….24
圖2.4-2 矽膠鍵結烷基………………………………………………………………..25
圖3.2-1 喜樹鹼標準品紫外吸收光譜………………………………………………..31
圖3.2-2實驗架構流程圖………………………………………………………………39
圖4.1-1 喜樹鹼溶在DMSO中全波長的UV吸收光譜………………..…………….41
圖4.1-2 閉環喜樹鹼(lactone form)層析圖…………………..……………………….42
圖4.1-3 破環喜樹鹼(carboxylate form)層析圖……..…………………………44
圖4.1-4 喜樹鹼標準品(lactone form)的檢量線……………………………………45
圖4.1-5 破環喜樹鹼標準品的檢量線………………………………………..………47
圖4.2-1 喜樹葉中喜樹鹼的含量與季節之關係……………………………………..49
圖4.2-2 不同溶劑對萃取效率的影響………………………………………………..51
圖4.2-3 由95% 酒精萃取比例對萃取效率之影響………………………………….52
圖4.2-4 由95 %乙醇萃取時間對萃取效率的影響…………………………………..53
圖4.2-5 由不同酒精濃度對萃取效率的影響………………………………………..54
圖4.2-6 由不同NaOH濃度對萃取效率的影響……………………………………..56
圖4.2-7 由50 mM氫氧化鈉溶液萃取時間對萃取效率的影響……………………..57
圖4.2-8 由不同pH值閉環對萃取效率的影響………………………………………58
圖4.2-9 二氯甲烷分液萃液在薄層層析的情形…..…………………………………62
圖4.2-10 喜樹鹼標準品(lactone form)…...……………………………………..66
圖4.2-11 酒精萃取喜樹鹼(lactone form).............................67
圖4.2-12 鹼法萃取喜樹鹼(lactone form)………………………………………….68

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