臺灣博碩士論文加值系統

摘 要
生物體內，許多生化及藥理反應都是由硫醇(thiol)化合物所參與，硫醇化合物在生物體中的含量可以當作健康指標。本論文分為兩部分，探討利用luminol-H2O2間接化學放光偵測法分別發展類半胱胺酸(homocysteine；HCys)及穀胱胺酸(glutathione；GSH)的分析方法。
論文第一部份利用間接化學放光偵測法配合毛細管電泳進行HCys的分析研究。電泳溶液組成為15 mM碳酸鈉緩衝溶液(pH＝9.0)含5 mM luminol與35 mM H2O2；催化劑溶液組成為15 mM碳酸鈉緩衝溶液(pH＝10.0)含30 μM硫酸銅與30 μM酒石酸。在最佳條件下偵測不經衍生的HCys，對數-對數檢量線線性範圍為1 × 10-5 ~1 × 10-3 M，線性相關係數0.998，偵測極限(S/N=3)為3 × 10-6 M。嘗試應用本方法於血漿樣品分析，先以氰甲烷(ACN)分離血漿中基質，但不成功。由於本方法對HCys的偵測靈敏度不足加上血漿基質組成複雜，實際分析血漿樣品中的微量HCys仍然有困難。
論文第二部份同樣利用間接化學放光偵測法配合毛細管電泳進行GSH的研究。最佳實驗條件與分析HCys相似，僅改變電泳緩衝溶液的pH值為9.5。GSH與半胱胺酸(cysteine；Cys)必須經由衍生反應改變其結構，才可與雙硫穀胱胺酸(glutathione, oxidized；GSSG)達到完全的分離。GSH的對數-對數檢量線線性範圍為1.0 × 10-5 ~ 5.0 × 10-3 M，線性相關係數0.986，偵測極限(S/N=3)為2.2 × 10-6 M。在最佳條件下應用本方法於紅血球中GSH分析，先利用超過濾去除紅血球樣品中複雜的基質，避免干擾GSH的定量。GSH的添加回收率為82.8 ﹪，相對標準偏差為9.5 ﹪。同時以傳統吸收光譜法來評估毛細管電泳/luminol-H2O2間接化學放光分析GSH結果的準確度。五個血液樣品利用毛細管電泳/luminol-H2O2間接化學放光方法與吸收光譜法測得的GSH值均落在一般正常人的GSH含量範圍內。證明毛細管電泳/luminol-H2O2間接化學放光偵測分析GSH具有很好的準確度。

目錄
謝誌……………………………………………………………………I
摘要……………………………………………………………………II
目錄……………………………………………………………………IV
表目錄…………………………………………………………………VII
圖目錄……………………………………………………...…………VIII

第一章 緒論…………………………………………………………1
1.1 毛細管電泳……………………………………………………….1
1.1.1 簡介………………………………………………………..1
1.1.2 毛細管電泳的偵測方法…………………………………..3
1.2 化學放光………………………………………………………….4
1.2.1 原理………………………………………………………..4
1.2.2 Luminol化學放光…………………………………………7
1.3 毛細管電泳/直接化學放光偵測…………………………………9
1.4毛細管電泳/間接化學放光偵測………………………………….16
1.5 含硫化合物簡介………………………………………………….21
1.5.1類半胱胺酸(HCys)、半胱氨酸(Cys)…………..………….23
1.5.2穀胱胺酸(GSH)...…………………………………………..24
1.6 研究目的……………………………………….………………….30
第二章 實驗…………………………………………………………..32
2.1 儀器設備………………………………………………………….32
2.2 化學藥品………………………………………………………….34
2.3 實驗方法………………………………………………………….37
2.3.1毛細管電泳/化學發光偵測裝置…………………………..37
2.3.2 溶液配製與注射方法……………………………………..39
2.3.2.1 電泳溶液的配製………………………………….39
2.3.2.2 催化劑溶液的配製……………………………….39
2.3.2.3 試劑溶液的配製………………………………….39
2.3.2.4 血液樣品的前處理……………………………….40
2.3.2.5 紅血球中GSH的分析步驟……………………...41
2.3.2.6電泳毛細管前處理與注射方式…………………..42
第三章 結果與討論…………………………………………………...44
3.1 類半胱胺酸(HCys)的分析…..……………………………………44
3.1.1電泳溶液的選擇……………………………………………..46
3.1.2 催化劑流速的影響………………………………………….46
3.1.3 過氧化氫濃度的影響……………………………………….49
3.1.4 緩衝溶液pH的影響………………………………………..51
3.1.5 Luminol濃度的影響………………………………………...54
3.1.6 電泳緩衝溶液濃度的影響…………………………………..56
3.1.7 催化劑溶液pH的影響……………………………………...56
3.1.8 最佳分析條件………………………………………………..59
3.1.9 類半胱胺酸(HCys)定量分析.……………………………….62
3.1.10 血漿樣品的分析……………………………………………64
3.2 穀胱胺酸(GSH)、雙穀胱胺酸(GSSG)、類半胱胺酸(HCys)、
半胱胺酸(Cys)的分析…………………………………………….68
3.2.1 衍生時間的探討…………………………………………….72
3.2.2 緩衝溶液pH的影響………………………………………..75
3.2.3 最佳分析條件……………………………………………….75
3.2.4 分析再現性的探討………………………………………….77
3.2.5 GSH、GSSG、HCys、Cys檢量線的製作…………………80
3.2.6 紅血球中GSH的分析……………………………………....85
3.2.7 回收率的探討………………………………………………..88
3.2.8 再現性的探討………………………………………………..88
3.2.9 方法正確性驗證……………………………………………..91
第四章 結論……………………………………………………………94
第五章 參考文獻………………………………………………………96
表目錄
表(一) 硫醇化合物分子量與pKa值………………………………...22
表(二) 毛細管電泳(CE)分析硫醇化合物……………………………27
表(三) 硫醇化合物的遷移時間、訊號高度、訊號面積之平均值及相對標準偏差…………………………………………………….79
表(四) 硫醇化合物的對數-對數檢量線線性範圍與方程式...………83
表(五) 硫醇化合物的定量極限及偵測極限…………………………84
表(六) 以超過濾前處理紅血球樣品中GSH回收率………………..90
表(七) 單因子變異數分析…………………………………………....90
表(八) CE-ICL偵測及吸收光譜法分析紅血球中GSH含量……….93



圖目錄
圖(一) 毛細管電泳儀裝置圖…………………………………………2
圖(二) Luminol 的化學放光反應…………………………………….8
圖(三) Hara所使用化學發光偵測器介面……………………………9
圖(四) 毛細管電泳/化學發光偵測裝置…………………………….. 11
圖(五) Sheath flow cuvette為介面的毛細管電泳/化學發光偵測器...13
圖(六) 毛細管末端的化學發光偵測器設計…………………………13
圖(七) 電驅動引進化學放光試劑系統………………………………15
圖(八) 電荷取代方式的間接偵測原理………………………………18
圖(九) 硫醇化合物的結構……………………………………………21
圖(十) T型毛細管連接介面裝置圖…………………………………..37
圖(十一) 化學放光強度與時間關係圖………………………………45
圖(十二) 電泳緩衝溶液對HCys訊號的影響……………………….47
圖(十三) 催化劑槽高度及流速對HCys訊號的影響……………….48
圖(十四) 電泳溶液中過氧化氫濃度對HCys訊號的影響………….50
圖(十五) 緩衝溶液pH值對HCys遷移時間的影響………………..52
圖(十六) 電泳緩衝溶液pH值對HCys訊號強度的影響…………...53
圖(十七) Luminol濃度對HCys訊號的影響…………………………55
圖(十八) 電泳緩衝溶液濃度對HCys訊號的影響…………………..57
圖(十九) 電泳緩衝溶液濃度對HCys遷移時間的影響……………..58
圖(二十) 催化劑溶液pH值對HCys訊號的影響……………………60
圖(二十一) 水樣中HCys的電泳圖…………………………………...61
圖(二十二) HCys的檢量線…………………………………………….63
圖(二十三) HCys的對數-對數檢量線…………………………………65
圖(二十四) 血漿樣品中HCys的電泳圖……………………………...66
圖(二十五) HCys、GSH、GSSG、Cys的電泳圖…………………….69
圖(二十六) 電泳緩衝溶液pH值對硫醇化合物分離的影響………...70
圖(二十七) 未經衍生的GSH及GSH衍生產物電泳圖..…………….73
圖(二十八) SBD-F衍生時間對GSH訊號的影響..……………………74
圖(二十九) 電泳緩衝溶液pH值對SBD-硫醇化合物衍生產物分離的影響……………………………………………...………...76
圖(三十) SBD-硫醇化合物衍生產物最佳電泳分離圖…….…………78
圖(三十一) 硫醇化合物檢量線……………………………………….81
圖(三十二) GSH的對數-對數檢量線……………….………………...82
圖(三十三) 紅血球樣品電泳圖……………………………………….87

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